[發明專利]一種圍產期臍帶源間充質干細胞主細胞庫的制備方法

在審

• 申請號: 201710374833.8
• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN107236702A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 張洪鈿;苑春慧
• 申請（專利權）人: 北京再生生物科技研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京紐樂康知識產權代理事務所(普通合伙)11210
• 代理人: 徐娟

1.一種圍產期臍帶源間充質干細胞主細胞庫的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.將足月剖腹產健康新生兒臍帶進行無菌采集；

S2.對產婦進行病原微生物篩查，對臍帶樣本進行無菌檢測；

S3.將臍帶樣本在生理鹽水中洗凈殘血，用消毒酒精浸泡，再經生理鹽水漂洗兩次；

S4.用生理鹽水灌注血管，擠出殘血，將臍帶樣本剪碎成組織塊，用生理鹽水漂洗3次；

S5.將明膠用去離子水溶解，濕熱滅菌,冷卻，緩慢加入2XDMEM（L），水浴搖床混勻；

S6.取組織塊，加入明膠溶液，轉移至組織培養瓶中平鋪，置于4℃冰箱中過夜后，向培養瓶中加入完全培養基，置于37℃，5% CO₂培養箱內培養，至細胞長滿凝膠層時收獲；

S7.收獲時以胰蛋白酶消化法收獲細胞，經細胞篩過濾、離心獲得P0代MSCs，P0代MSCs凍存，即為臍帶源MSCs主細胞庫。

2.根據權利要求1所述的一種圍產期臍帶源間充質干細胞主細胞庫的制備方法，其特征在于，所述步驟S1中新生兒臍帶進行無菌采集長度為15-20cm，兩端結扎，所述步驟S3中經生理鹽水漂洗兩次后，需要在結扎處剪斷，棄去兩端。

3.根據權利要求1所述的一種圍產期臍帶源間充質干細胞主細胞庫的制備方法，其特征在于，所述步驟S3中使用75%的消毒酒精浸泡30秒。

4.根據權利要求1所述的一種圍產期臍帶源間充質干細胞主細胞庫的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中產婦經病原微生物篩查，應無HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV、TP感染，臍帶樣本浸泡在生理鹽水中，采集殘血血樣進行無菌檢測，結果應為陰性，進行支原體檢測，結果應為陰性。

5.根據權利要求1所述的一種圍產期臍帶源間充質干細胞主細胞庫的制備方法，其特征在于，所述步驟S5中，所用明膠為24g，以55℃100mL去離子水溶解，116℃條件下濕熱滅菌15分鐘，冷卻至40℃，緩慢加入預溫至40℃的100mL2XDMEM（L）中，水浴搖床混勻。

6.根據權利要求5所述的一種圍產期臍帶源間充質干細胞主細胞庫的制備方法，其特征在于，所述DMEM（L）含有4%的Ultroser G serum substitute，所述DMEM（L）中rh b-FGF的濃度為50ng/mL。

7.根據權利要求1所述的一種圍產期臍帶源間充質干細胞主細胞庫的制備方法，其特征在于，所述步驟S6中，取2cm臍帶樣品剪碎獲得的約40塊組織塊，加入15ml明膠溶液，攪拌混勻，轉移至組織培養瓶中平鋪，置于4℃冰箱中過夜后，每個培養瓶中緩慢加入15ml完全培養基，置于37℃，5% CO₂培養箱內培養，每3天觀察，每7天換液，至細胞長滿凝膠層時收獲。

8.根據權利要求7所述的一種圍產期臍帶源間充質干細胞主細胞庫的制備方法，其特征在于，步驟S6中所述的完全培養基為DMEM（L），所述完全培養基含有40%的MCDB201、1%的ITS、2%的FBS，所述完全培養基中地塞米松濃度為50 nmol/L，抗壞血酸濃度為0.1 mmol/L，rh LIF濃度為10³U/mL，rh PDGF-b濃度為10ng/mL，rh EGF濃度為10ng/mL。

9.根據權利要求1所述的一種圍產期臍帶源間充質干細胞主細胞庫的制備方法，其特征在于，所述步驟S7中，收獲細胞時，小心吸棄培養上清，加入5mL含0.08%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液，震蕩混勻，室溫消化10min；加入1mL抑肽酶溶液終止消化；400g離心，5min，棄上清，收獲沉淀物；以生理鹽水洗滌2次，以100um尼龍細胞篩過濾，收集濾液；400g離心，5min，棄上清，收獲沉淀物；記為P0代；P0代細胞凍存，即為臍帶源MSCs主細胞庫。