[發明專利]一種激肽釋放酶7在血液中的含量檢測方法及其作為診斷胰腺癌的血清標志物上的應用

在審

• 申請號: 201710374234.6
• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN108931651A
• 公開（公告）日: 2018-12-04
• 發明（設計）人: 鄭軍;譚瀟;劉森;李林;張丁
• 申請（專利權）人: 宜昌市中心人民醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所 42103
• 代理人: 蔣悅

本發明提供一種激肽釋放酶7在血液中的含量檢測方法，具體為將所收集的待測血液樣品按要求于4℃冰箱靜置12小時后離心取上清液并保存于?80℃冰箱。檢測前血清用1×PBS液按1：5進行稀釋分裝待檢測實驗；分配96孔酶聯板，加入50μL待測血清樣品，輕搖孵育2h；去除孔內的液體，加入wash buffer洗孔3次，每次加入washbuffer后放置搖床5min，將吸水紙平鋪于桌面，輕拍酶聯板將孔內液體去除干凈；加入HRP于每孔內，輕搖孵育；再加入TMB液孵育30min；向每孔內加入100μl stop solution終止反應；加入stop solution終止液后輕搖混勻，確保藍色全部變為黃色；測量光密度（OD值），根據標準曲線將光密度（OD值）轉換為KLK7在血清中的含量值，即可完成激肽釋放酶7在血液中的含量檢測。

技術領域

本發明涉及醫藥領域，特別是指激肽釋放酶7(Kallikrein 7)在血液中的含量檢測及其在胰腺癌臨床診斷中的應用。

背景技術

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統腫瘤，病死率約占年發病率的83％。20世紀80年代，胰腺癌的5年生存率約3％，到21世紀初達到7％。由于起病隱匿，加之胰腺具有獨特的解剖結構和生物學特性，60％的胰腺癌患者確診時已存在遠處轉移，且對傳統放化療等治療手段不敏感，故預后極差，中位生存期僅6至9個月。胰腺導管腺癌是胰腺癌中最常見的病理類型，囊腺癌、神經內分泌腫瘤、肉瘤、腺泡細胞癌和淋巴瘤等病理類型臨床相對少見。手術切除仍是目前治療胰腺癌的主要措施，但由于缺乏有效的早期診斷，只有約10％～20％的病人就診時適宜手術切除，這部分病人僅占胰腺癌病人總數的極小部分。70％～80％的病人由于腫瘤無法切除，必須通過非手術治療來改善生活質量并延長生存期。即使是腫瘤切除的病人，既往研究也表明擴大手術范圍和廣泛淋巴結清掃并不能進一步提高胰腺癌的存活率。因此重視胰腺癌的早期診斷，提高胰腺癌早期確診率，增加胰腺癌患者手術切除機會是提高胰腺癌存活率的一個重要環節。

人組織激肽釋放酶7(kallikrein-related peptidase 7，KLK7)亦稱角質層胰凝乳蛋白酶(stratum corneumchymotryptic enzyme，SCCE)，最初是從皮膚中提取鑒定的一種分泌型蛋白質。KLK7基因是激肽釋放酶家族15個成員之一，與其他激肽釋放酶基因在堿基序列水平有高度同源性，其編碼的蛋白與同家族其他成員在氨基酸水平同源性亦較高，蛋白質三級結構和功能有很多相似性。在人體很多體液中均可檢測到較高水平的KLK7蛋白，如：羊水、卵巢癌患者腹水、腦脊液、乳汁、唾液、精液、血清、關節滑膜液、尿液、汗液等。在皮膚中，KLK7通過水解細胞間介導凝聚的交界結構胞外粘合蛋白包括橋粒芯蛋白、橋粒糖蛋白等，導致皮膚的脫屑。國內外大量研究表明KLK7與腫瘤的侵襲與轉移息息相關，其可能的機制是其水解細胞外基質，促進細胞脫離，腫瘤細胞借此更易侵襲與轉移。VladimirIakovlev等應用組織芯片免疫組化法檢測包含胰腺癌不同發展過程(胰腺正常組織、胰腺上皮內瘤變與侵襲性胰腺導管腺癌)的全組織切片中KLK7表達水平，以評估KLK7對胰腺癌預后意義，研究發現在胰腺上皮內瘤變進展中后期開始出現KLK7表達異常，胰腺導管腺癌中KLK7表達增高與預后不佳相關。另外，有體外實驗研究顯示：KLK7水解上皮型鈣粘蛋白，產生的可溶性上皮型鈣粘蛋白片段，可顯著增強PANC-1細胞侵襲細胞外基質蛋白的能力，而胰腺癌PANC-1細胞聚集相應減少。提示KLK7可能在胰腺癌的侵襲和轉移過程中起重要作用，胰腺癌細胞表面存在KLK7可造成腫瘤細胞脫落，導致腫瘤早期發生轉移。

到目前為止，還沒有一種有效的血清標志物用于胰腺癌臨床診治中。通過免疫組化實驗，我們發現在胰腺癌組織中KLK7的蛋白表達量相對于癌旁組織大幅上調，且胰腺組織附近血管豐富，因此我們猜測在血清中胰腺癌患者的KLK7含量相對于正常人來說也會升高。因此，如果KLK7能作為胰腺癌輔助診斷的血清標志物，對胰腺癌患者的早期診斷及治療方案的選擇將具有極大的臨床應用價值。

發明內容