[發(fā)明專利]一種激肽釋放酶7在血液中的活性檢測方法及其作為診斷胰腺癌的血清標(biāo)志物上的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710373623.7
• 申請(qǐng)日: 2017-05-24
• 公開（公告）號(hào): CN108931650A
• 公開（公告）日: 2018-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚瀟;劉森;鄭軍;李林;張丁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 宜昌市中心人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務(wù)所 42103
• 代理人: 蔣悅

本發(fā)明提供一種激肽釋放酶7在血液中的活性檢測方法，具體為將所收集的待測血液樣品于4℃冰箱靜置12小時(shí)后離心取上清液并保存于?80℃冰箱。檢測前血清用1×PBS液按1：5進(jìn)行稀釋分裝待檢測實(shí)驗(yàn)；分配96孔酶聯(lián)板，加入50μL待測血清樣品，輕搖孵育2h；去除孔內(nèi)的液體，加入wash buffer洗孔3次，每次加入washbuffer后放置搖床5min，將吸水紙平鋪于桌面，輕拍酶聯(lián)板使孔內(nèi)液體去除干凈；加入KLK7 FRET熒光底物McaRPKPVENvalWRK(Dnp)NH₂于每孔內(nèi)，于37℃下置于搖床上輕搖孵育30min；于熒光酶標(biāo)儀中在激發(fā)光波長320nm，發(fā)射光波長405nm下進(jìn)行檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是指激肽釋放酶7(Kallikrein 7)在血液中的活性檢測及其在胰腺癌臨床診斷中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，病死率約占年發(fā)病率的83％。20世紀(jì)80年代，胰腺癌的5年生存率約3％，到21世紀(jì)初達(dá)到7％。由于起病隱匿，加之胰腺具有獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，60％的胰腺癌患者確診時(shí)已存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且對(duì)傳統(tǒng)放化療等治療手段不敏感，故預(yù)后極差，中位生存期僅6至9個(gè)月。胰腺導(dǎo)管腺癌是胰腺癌中最常見的病理類型，囊腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、肉瘤、腺泡細(xì)胞癌和淋巴瘤等病理類型臨床相對(duì)少見。手術(shù)切除仍是目前治療胰腺癌的主要措施，但由于缺乏有效的早期診斷，只有約10％～20％的病人就診時(shí)適宜手術(shù)切除，這部分病人僅占胰腺癌病人總數(shù)的極小部分。70％～80％的病人由于腫瘤無法切除，必須通過非手術(shù)治療來改善生活質(zhì)量并延長生存期。即使是腫瘤切除的病人，既往研究也表明擴(kuò)大手術(shù)范圍和廣泛淋巴結(jié)清掃并不能進(jìn)一步提高胰腺癌的存活率。因此重視胰腺癌的早期診斷，提高胰腺癌早期確診率，增加胰腺癌患者手術(shù)切除機(jī)會(huì)是提高胰腺癌存活率的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

人組織激肽釋放酶7(kallikrein-related peptidase 7，KLK7)亦稱角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(stratum corneumchymotryptic enzyme，SCCE)，最初是從皮膚中提取鑒定的一種分泌型蛋白質(zhì)。KLK7基因是激肽釋放酶家族15個(gè)成員之一，與其他激肽釋放酶基因在堿基序列水平有高度同源性，其編碼的蛋白與同家族其他成員在氨基酸水平同源性亦較高，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能有很多相似性。在人體很多體液中均可檢測到較高水平的KLK7蛋白，如：羊水、卵巢癌患者腹水、腦脊液、乳汁、唾液、精液、血清、關(guān)節(jié)滑膜液、尿液、汗液等。在皮膚中，KLK7通過水解細(xì)胞間介導(dǎo)凝聚的交界結(jié)構(gòu)胞外粘合蛋白包括橋粒芯蛋白、橋粒糖蛋白等，導(dǎo)致皮膚的脫屑。國內(nèi)外大量研究表明KLK7與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，其可能的機(jī)制是其水解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞脫離，腫瘤細(xì)胞借此更易侵襲與轉(zhuǎn)移。VladimirIakovlev等應(yīng)用組織芯片免疫組化法檢測包含胰腺癌不同發(fā)展過程(胰腺正常組織、胰腺上皮內(nèi)瘤變與侵襲性胰腺導(dǎo)管腺癌)的全組織切片中KLK7表達(dá)水平，以評(píng)估KLK7對(duì)胰腺癌預(yù)后意義，研究發(fā)現(xiàn)在胰腺上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展中后期開始出現(xiàn)KLK7表達(dá)異常，胰腺導(dǎo)管腺癌中KLK7表達(dá)增高與預(yù)后不佳相關(guān)。另外，有體外實(shí)驗(yàn)研究顯示：KLK7水解上皮型鈣粘蛋白，產(chǎn)生的可溶性上皮型鈣粘蛋白片段，可顯著增強(qiáng)PANC-1細(xì)胞侵襲細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的能力，而胰腺癌PANC-1細(xì)胞聚集相應(yīng)減少。提示KLK7可能在胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，胰腺癌細(xì)胞表面存在KLK7可造成腫瘤細(xì)胞脫落，導(dǎo)致腫瘤早期發(fā)生轉(zhuǎn)移。

到目前為止，還沒有一種有效的血清標(biāo)志物用于胰腺癌臨床診治中。通過免疫組化實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)在胰腺癌組織中KLK7的蛋白表達(dá)量相對(duì)于癌旁組織大幅上調(diào)，且胰腺組織附近血管豐富，因此我們猜測在血清中胰腺癌患者的KLK7含量相對(duì)于正常人來說也會(huì)升高。因此，如果KLK7能作為胰腺癌輔助診斷的血清標(biāo)志物，對(duì)胰腺癌患者的早期診斷及治療方案的選擇將具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種胰腺癌血清標(biāo)志物的檢測方法，并將該檢測方法與影像學(xué)技術(shù)及其它生物學(xué)標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，用于胰腺癌患者的臨床早期輔助診斷中。