[發明專利]一種基于煙粉虱化學感受蛋白的植物驅避劑篩選方法

在審

• 申請號: 201710371817.3
• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN106990083A
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發明（設計）人: 羅晨;李紅亮;穆常青;吳帆
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/68;C12N15/70;C07K14/435
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙)11333
• 代理人: 胡敬紅

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種基于煙粉虱化學感受蛋白的植物驅避劑篩選方法。

背景技術

煙粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)是一種多食性的檢疫性害蟲，近三十年以來，隨著農產品、苗木和花卉等作物國際貿易往來和跨地區傳運，煙粉虱不斷地向世界各地區擴張，已成為一種著名的外來入侵性害蟲。盡管煙粉虱寄主種類非常多，保守估計已超過74科600余種，但其對不同寄主植物存在較大的嗜性差異——這與其對不同植物揮發物氣味的反應差異明顯有關。如煙粉虱可以對某些植物表現出較強的驅避行為，因此通過這些植物氣味揮發物可以設計和開發基于驅避行為的煙粉虱氣味驅避劑。然而煙粉虱驅避植物種類眾多復雜，如何快速地篩選出合適的驅避劑配方成為制約煙粉虱氣味驅避劑開發和設計的瓶頸。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種基于煙粉虱化學感受蛋白的氣味驅避劑篩選方法，本發明基于煙粉虱植物源的驅避劑配方的篩選和設計提供了新的策略。

一種基于煙粉虱化學感受蛋白的植物驅避劑篩選方法，其特征在于包括以下工藝步驟：

1)提供煙粉虱化學感受蛋白BtabCSP1，

2)通過競爭性熒光結合方法獲得煙粉虱化學感受蛋白BtabCSP1與氣味的結合反應譜，并計算結合常數K_A或解離常數K_D，

3)如果煙粉虱氣味物質將1-NPN與BtabCSP1相對熒光值競爭至50％以下，并且結合常數K_A高于1.2×10⁴L/μmol以上或解離常數K_D低于60μmol/L以下時，確定為適合煙粉虱的氣味驅避劑。

所述的步驟2)中競爭性熒光結合方法獲得煙粉虱重組化學感受蛋白與氣味的結合反應譜的方法步驟包括：

(1)熒光配基1-NPN與煙粉虱化學感受蛋白的結合，測定熒光值，

(2)選取煙粉虱氣味物質和1-NPN進行競爭結合煙粉虱重組化學感受蛋白，測定1-NPN與BtabCSP1相對熒光值，計算結合常數K_A。

所述步驟(1)的方法為：在281nm激發波長下，向1μmol/L的煙粉虱化學感受蛋白中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混勻。

所述步驟2)后還有氣味驅避劑的驗證步驟，所述驗證采用Y型嗅覺儀測試。

所述步驟1)中煙粉虱化學感受蛋白BtabCSP1的獲取方法為：

A)提取煙粉虱成蟲含觸角在內的頭部總RNA；

B)設計煙粉虱化學感受蛋白基因引物，通過RT-PCR獲得煙粉虱化學感受蛋白基因全長；

C)構建煙粉虱化學感受蛋白基因的原核表達載體；

D)通過IPTG誘導煙粉虱重組化學感受蛋白重組表達，并通過鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱對其進行純化；

步驟D)中IPTG誘導煙粉虱重組化學感受蛋白表達的誘導條件為：IPTG濃度為0.5mmol/L，溫度為30℃，誘導轉速為200rpm，誘導時間為5h。

本發明從煙粉虱嗅覺生理的模式出發，通過分子生物學技術克隆了其化學感受蛋白基因全長，并通過載體構建和原核表達技術獲得了編碼該基因的重組蛋白，最后通過生物化學配基結合技術探討了其與氣味物質的親和力。本發明同時證明煙粉虱化學感受蛋白BtabCSP1可以作為上述方法篩選煙粉虱植物源驅避劑，本發明基于煙粉虱植物源的驅避劑篩選和設計提供了新的策略。

附圖說明

圖1為重組煙粉虱化學感受蛋白BtabCSP1的分離純化；

圖中：M：蛋白分子量標準；0：未誘導的pET30/BtabCSP1的BL21(DE3)菌體；1：誘導的1～6h優化表達產物，

圖2為重組BtabCSP1蛋白與熒光配基1-NPN的熒光結合曲線圖；

圖3為候選配基與熒光配基1-NPN和重組BtabCSP1蛋白的競爭結合圖；

圖4為煙粉虱對不同氣味驅避物質的嗅覺行為反應對熒光結合驗證圖。

具體實施方式

以下結合實施例對本發明做進一步說明。

實施例1：收集煙粉虱頭部(含觸角)總RNA以及化學感受蛋白CSP1的基因克隆

1煙粉虱化學感受蛋白BtabCSP1(GenBank登錄號GU250808)的克隆

1.1煙粉虱總RNA的提取