[發(fā)明專(zhuān)利]一種桑葉免疫活性肽及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710370646.2
• 申請(qǐng)日: 2017-05-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107119097B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳暉;孫崇臻;賴(lài)富饒;武文佳;閔甜
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P21/06
• 分類(lèi)號(hào): C12P21/06;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 廣州粵高專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

1.一種桑葉免疫活性肽的制備方法，其特征在于，用中性蛋白酶單獨(dú)酶解或，堿性蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)合酶解，并用DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子柱層析、Sephadex G-50、G-25或G-15凝膠柱層析及RP-HPLC對(duì)其進(jìn)行分離純化制備，得到桑葉免疫活性肽；

包括以下步驟：

（1）桑葉免疫活性肽粗品制備：新鮮桑葉洗凈晾干，粉碎后過(guò)篩，得桑葉粉；提取桑葉蛋白后，取桑葉蛋白用水溶解，配制成質(zhì)量濃度為1%-10 %的溶液， 在95-100℃蛋白變性5min，冷卻后采用加入中性蛋白酶單獨(dú)酶解或，堿性蛋白酶與中性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解后95-100 ℃滅酶活10 min，冷卻至室溫后，在離心力為5000-10000g條件下離心15-20 min，取上清冷凍干燥得到具有免疫活性的桑葉肽粗品；蛋白酶的總添加量為底物質(zhì)量的1%-5%；

（2）桑葉免疫活性肽的分離純化：將（1）中桑葉免疫活性肽粗品用Tris-HCl或者去離子水溶解，并用0.22-0.45 μm的濾膜過(guò)濾；取10-30 mL濾液通過(guò)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子柱層析，用不同濃度的NaCl溶液沖洗柱子，收集組分；100 Da透析袋透析脫鹽，冷凍干燥后用水溶解，進(jìn)行免疫活性測(cè)定，將活性最高的組分通過(guò)Sephadex G-50、G-25或G-15凝膠柱層析分離，收集分離的組分進(jìn)行冷凍干燥，測(cè)定免疫活性，收集活性高的組分用RP-HPLC進(jìn)一步分離純化，所得組分冷凍干燥后測(cè)定免疫活性，活性最高的組分即為桑葉免疫活性肽。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述桑葉免疫活性肽的制備方法，其特征在于，步驟（1）桑葉蛋白的提取采用水提鹽沉或堿提酸沉法。

3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述桑葉免疫活性肽的制備方法，其特征在于，步驟（1）中，當(dāng)選用中性蛋白酶單獨(dú)酶解時(shí)，條件為：中性蛋白酶37-45 ℃，pH 6.8 -7.2，單獨(dú)酶解時(shí)間均為1-8 h，酶底濃度為1-6%；當(dāng)選用堿性蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)合酶解時(shí)，酶解條件為：在單獨(dú)酶解條件下，各自酶解時(shí)間控制在1-4h。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述桑葉免疫活性肽的制備方法，其特征在于，所述Tris-HCl濃度為15-25 mM，pH 為7.2-8.2。

5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述桑葉免疫活性肽的制備方法，其特征在于，步驟（2）所述過(guò)離子柱的溶液濃度為5-30 mg/mL；NaCl洗脫液濃度為0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1 mol/L；洗脫流速1.0-1.5 mL/min，8min/管，每個(gè)洗脫濃度接收40管。

6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述桑葉免疫活性肽的制備方法，其特征在于，步驟（2）所述Sephadex G-50、G-25或G-15凝膠柱層析的溶液濃度為5-30 mg/mL，加樣體積1-5 mL，純水洗脫，洗脫流速0.3-0.8 mL/min，3-6 min/管。

7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述桑葉免疫活性肽的制備方法，其特征在于，步驟（2）中采用RP-HPLC分離純化的條件為：使用C₁₈柱，上樣濃度0.5-20 mg/mL，上樣體積0.02-5 mL；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；流動(dòng)相為A：0.05-0.3%的三氟乙酸（TFA），B：含0.05-0.3%TFA的乙腈；洗脫梯度為：?jiǎn)蚊该附猱a(chǎn)物：0-9-10-30-31-35min，90-90-65-50-90-90%的流動(dòng)相A；復(fù)合酶解產(chǎn)物：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流動(dòng)相A，流速為0.2-20 mL/min。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述桑葉免疫活性肽的制備方法，其特征在于，所述桑葉肽進(jìn)行免疫活性分析：包括巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌細(xì)胞因子NO，IL-6，TNF-α的能力及胞飲中性紅的能力。

9.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法制備的一種具有免疫活性的桑葉肽。