[發明專利]用于H5亞型禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法和應用

在審

• 申請號: 201710369846.6
• 申請日: 2017-05-23
• 公開（公告）號: CN107267665A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 賈偉新;曹琛福;廖明;花群義;林彥星;謝淑敏
• 申請（專利權）人: 華南農業大學;深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司44281
• 代理人: 彭家恩

技術領域

本申請涉及禽流感病毒檢測領域，特別是涉及一種用于H5亞型禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法和應用。

背景技術

自1996年H5N1高致病性禽流感在我國廣東地區發生以來，該病毒所感染的宿主范圍越來越廣，包括了很多的鳥類、哺乳動物甚至人類。H5N1病毒不僅給許多國家的養禽業帶來了沉重打擊，同時也向全人類的健康提出了嚴峻挑戰。2004年開始，韓國、越南、中國、日本等多個亞洲國家相繼發生高致病性H5N1亞型禽流感疫情。此后，病毒擴散范圍逐步擴大，歐洲、中東及非洲地區也相繼出現疫情，目前該亞型病毒已傳播到全世界范圍內的60多個國家。1997年，被認為只局限于禽類宿主中存在的H5N1亞型禽流感病毒，卻造成了人類的感染并能夠引起死亡，這也是全世界首例不需要中間宿主而使人直接感染禽流感病毒的事件。此后人感染H5N1亞型流感病例時有發生，截至2017年2月14日，H5N1亞型禽流感病毒已在全世界范圍內16個國家造成共856例感染病例，其中死452例。雖然目前H5N1禽流感病毒還沒有獲得在人與人之間的高效傳播的能力，但是病毒表面HA基因不斷變異，內部基因頻繁重組，大大加快了該病毒的遺傳進化和傳播擴散，使其宿主范圍不斷擴大的同時對人類的安全威脅也越來越大。H5亞型高致病性禽流感病毒除了H5N1亞型之外，還存在多種其他NA亞型病毒，目前我國H5亞型高致病性禽流感呈現了H5N1、H5N2、H5N6和H5N8等多個血清亞型的毒株同時在禽群中流行的特點。2014年以來我國H5亞型高致病性禽流感主要流行的亞型為H5N6亞型，2014年我國四川也出現了首例人感染H5N6亞型禽流感病例。H5亞型禽流感病毒的基因型也不斷發生著變化，從早期的0分支發展進化為目前多分支同時存在的局面，我國當前主要流行2.3.4.4分支和2.3.2.1分支毒株，每個進化分支又分化為多個小分支，這為H5亞型禽流感病毒的早期檢測和防控帶來挑戰。

重組酶聚合酶核酸擴增技術RPA(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術，RPA能夠在15分鐘內進行37℃-42℃常溫的單分子核酸擴增。RPA技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，其擴增原理是：重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物。目前尚沒有H5亞型禽流感病毒的RPA檢測研究和報道。

發明內容

本申請的目的是提供一種用于H5亞型禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法和應用。

本申請采用了以下技術方案：

本申請的一方面公開了一種用于H5亞型禽流感病毒檢測的試劑，該試劑包括引物對和探針，引物對的上游引物為Seq ID No.1所示序列，引物對的下游引物為Seq ID No.2所示序列，探針為Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互補序列；

Seq ID No.1：5’-GACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGG-3’

Seq ID No.2：5’-CTTTTTAATCTTGCTTCTTCTGAATACTG-3’

Seq ID No.3：

5’-GGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAG TG-3’

Seq ID No.3所示序列的探針中，第27個堿基修飾BHQ1-dT，第30個堿基修飾6-FAM-dT，第28個堿基替換為dSpacer，3’端修飾C3Spacer。

需要說明的是，在熒光檢測中，探針是特異性的結合到雙鏈的其中一條鏈的，只要PCR擴增的時候，將結合的探針破壞，即可產生熒光信號，因此，可以采用Seq ID No.3所示序列的探針結合到其中一條鏈上，也可以采用Seq ID No.3所示序列的反向互補序列作為探針結合到另一條鏈上，探針的修飾方式不變。