[發明專利]用于H5亞型禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法和應用

在審

• 申請號: 201710369846.6
• 申請日: 2017-05-23
• 公開（公告）號: CN107267665A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 賈偉新;曹琛福;廖明;花群義;林彥星;謝淑敏
• 申請（專利權）人: 華南農業大學;深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司44281
• 代理人: 彭家恩

1.一種用于H5亞型禽流感病毒檢測的試劑，其特征在于：所述試劑包括引物對和探針，所述引物對的上游引物為Seq ID No.1所示序列，所述引物對的下游引物為Seq ID No.2所示序列，所述探針為Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互補序列；

Seq ID No.1：5’-GACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGG-3’

Seq ID No.2：5’-CTTTTTAATCTTGCTTCTTCTGAATACTG-3’

Seq ID No.3：

5’-GGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTG-3’

Seq ID No.3所示序列的探針中，第27個堿基修飾BHQ1-dT，第30個堿基修飾6-FAM-dT，第28個堿基替換為dSpacer，3’端修飾C3 Spacer。

2.根據權利要求1所述的用于H5亞型禽流感病毒檢測的試劑在H5亞型禽流感病毒檢測中的應用。

3.根據權利要求1所述的用于H5亞型禽流感病毒檢測的試劑在制備H5亞型禽流感病毒檢測試劑盒或設備中的應用。

4.一種用于H5亞型禽流感病毒檢測的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中含有權利要求1所述的用于H5亞型禽流感病毒檢測的試劑。

5.一種用于H5亞型禽流感病毒檢測的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中含有至少一組混合試劑，每組混合試劑由RT-RPA反應緩沖液29.5μL、10μM的上游引物2.1μL、10μM的下游引物2.1μL和10μM的探針0.6μL組成；所述上游引物為Seq ID No.1所示序列，所述下游引物為Seq ID No.2所示序列，所述探針為Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互補序列，并且，Seq ID No.3所示序列的探針中，第27個堿基修飾BHQ1-dT，第30個堿基修飾6-FAM-dT，第28個堿基替換為dSpacer，3’端修飾C3 Spacer。

6.一種用于H5亞型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的核酸；

(2)采用權利要求5所述的試劑盒，向所述混合試劑中加入步驟(1)提取的核酸，再加入DEPC水和醋酸鎂，配制成反應溶液；

(3)將步驟(2)配制的反應溶液，在40℃恒溫反應，整個反應過程采集熒光信號。

7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于：所述40℃恒溫反應具體包括，先將步驟(2)配制的反應溶液，在40℃保溫5min，然后取出裝反應溶液的PCR管上下輕輕顛倒數次，瞬時離心，再繼續40℃下反應15min，整個反應過程采集熒光信號。

8.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于：所述采集熒光信號的過程中，FAM熒光通道光源強度設置為11％。

9.根據權利要求6-8任一項所述的檢測方法，其特征在于：還包括，采集40℃恒溫反應前5min各點熒光值，計算其平均值，作為第一熒光值；采集40℃恒溫反應5min后任意時間點的熒光值，作為第二熒光值；根據熒光增量判斷待測樣品為陽性或陰性，具體的，熒光增量大于55％，且持續的時間超過2分鐘，判為陽性，否則判為陰性；

熒光增量＝[(第二熒光值-第一熒光值)/第一熒光值]×100％。

10.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于：所述步驟(1)提取待測樣品的核酸，采用MagMAX^TM-96 Viral RNA Isolation Kit磁珠提取試劑盒，或者Trizol核酸抽提法。