[發明專利]一種提高m6A抗體富集甲基化mRNA產量的方法

在審

• 申請號: 201710369026.7
• 申請日: 2017-05-23
• 公開（公告）號: CN107312772A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 鐘翔;余嘉瑤;李興美;李毅;王恬;張莉莉;王超
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司32218
• 代理人: 徐冬濤,李曉峰

技術領域：

本發明屬于醫學生物技術領域，具體涉及一種提高m⁶A抗體富集甲基化mRNA產量的方法。

技術背景：

信使RNA(mRNA)是聯系DNA與蛋白質的核心分子，其參與的遺傳信息傳遞過程是生命的核心進程。雖然mRNA的修飾在20世紀70年代就已經被發現，但是由于mRNA本身的特性和技術的限制，使得mRNA的修飾研究進展較為緩慢。隨著m⁶A-seq、MeRIP、miCLIP、m¹A-seq、m¹A-ID-seq、Aza-IP、hMeRIP-seq、ψ-seq、CeU-seq和RiboMeth-seq等一系列技術的產生，轉錄組范圍內mRNA分子的m⁶A、m¹A、m⁵C、5hmC、假尿嘧啶修飾和2'-O-甲基化等修飾位點信息被揭示。近兩年來，mRNA修飾研究出現了井噴式的發展，尤其是m⁶A(6-甲基腺嘌呤),成為了RNA生物學研究的一個新興領域。

m⁶A修飾是廣泛存在于真核高等生物的RNA上，特別是在mRNA上，該修飾主要存在于mRNA是CDS區的3’-UTR區，特別是終止密碼子附近區域，其廣泛參與了RNA代謝的各種生物學過程，包括RNA剪接、RNA出核、RNA與蛋白互相作用和RNA降解。哺乳動物體內m⁶A甲基轉移酶復合物中有一部分成分已被解析，主要有METTL3(Me-thyltransferase-like protein 3)、METTL14(Methyltransferase-like protein 14)和WTAP(Wilms tumor 1-associating protein)。m⁶A去甲基酶肥胖蛋白FTO(Fat mass and obesity associated protein)和ALKBH5(AlkB homolog 5)依賴α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid,α-KG)和Fe(Ⅱ)對m⁶A進行氧化去甲基化反應。m⁶A在生物體內由m⁶A結合蛋白識別，并介導其行使功能。目前發現的m⁶A結合蛋白有YTH結構域蛋白YTHDF1(YTH domain-containing family protein 1)、YTHDF2(YTH domain-containing family protein 2)、YTHDC1(YTH domain-containing protein 1)和核內HNRNPA2B1(Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2B1)。

m⁶A作為一個新穎的RNA表觀遺傳修飾對于基因表達等基礎生命進程發揮著重要作用，包括調控生物節律、減數分裂和胚胎干細胞增殖等。Dominissini等發現，沉默m6A甲基轉移酶可以顯著影響基因表達水平和選擇性剪接模式，從而影響p53信號通路和細胞凋亡。Meyer等發現，m⁶A修飾呈現組織特異性調控，其在腦的發育過程中會顯著增加。此外，他們還發現有67％的3'-UTR存在m⁶A修飾，而這些3'-UTR同時會有至少一個Target Scan預測的microRNA結合位點，并且這些m⁶A修飾位點大都在microRNA結合位點的上游。在腦組織的進一步實驗顯示，那些表達量較高的microRNA的靶標也會有較高的m⁶A修飾水平，這暗示microRNA水平可能調控著其靶標轉錄本的m⁶A水平。Batista等的研究表明，m⁶A可以促使干細胞從自我更新狀態轉向細胞分化。2015年，Geula等關于m⁶A修飾對胚胎干細胞多能性調控作用的研究表明，m⁶A能夠通過影響促多能性基因的mRNA水平與穩定性，對ESCs的多能性進行調控。