[發(fā)明專利]一種利用雞胚血管系統(tǒng)檢測和評價(jià)結(jié)膜刺激性及粘膜刺激性的方法

在審

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• 申請日: 2017-05-22
• 公開（公告）號: CN107271653A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦瑤;程樹軍;陳志杰
• 申請（專利權(quán)）人: 秦瑤;廣州市華代生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司44104
• 代理人: 周克佑

1.一種利用雞胚血管系統(tǒng)檢測和評價(jià)結(jié)膜刺激性及粘膜刺激性的方法，其特征是包含以下步驟：

(1)絨毛尿囊膜的制備

選取SPF級受精雞胚，制備具有絨毛尿囊膜的受精雞胚備用；

(2)結(jié)膜刺激試驗(yàn)

2.1受試物制備

選取受試物，用溶劑溶解后，配制一組具有濃度梯度的稀釋液備用，并設(shè)置陽性對照、陰性對照和基準(zhǔn)對照；

2.2篩查試驗(yàn)

選取受試物，用溶劑溶解后，重新配制一組具有濃度梯度的稀釋液，進(jìn)行受試物結(jié)膜刺激范圍篩查試驗(yàn)，確定引起雞胚反應(yīng)的大概濃度范圍；

2.3結(jié)膜刺激性RC₅₀確定試驗(yàn)

選取受試物，用溶劑溶解后，再重新配制一組具有濃度梯度的稀釋液，取步驟(1)中制備的受精雞胚，在所述受精雞胚的雞胚尿囊膜上放置特富龍“О”形環(huán)，將該組具有濃度梯度的稀釋液、陽性對照、陰性對照和基準(zhǔn)對照分別加入到特富龍“О”形環(huán)，恒溫培養(yǎng)箱孵育后，觀察錄血管的各種變化，并與環(huán)外血管相比較，血管的變化按照表1進(jìn)行判定和分級，血管反應(yīng)分級在1級以上為血管反應(yīng)陽性，按對數(shù)圖計(jì)算結(jié)膜刺激性RC₅₀的值，即使半數(shù)雞胚出現(xiàn)陽性反應(yīng)的受試物濃度；

表1光毒性和結(jié)膜刺激的血管反應(yīng)觀察及分級

分級觀察描述0觀察不到血管褪色或者出血，血管膜正常1血管白色無血液，管壁清晰；或/和毛細(xì)血管充血2毛細(xì)胞血管可見細(xì)小出血點(diǎn)，出血面積＜20％3明顯的血管出血，散在或出血區(qū)域＞20％，＜50％4嚴(yán)重出血，出血區(qū)域超過50％

(3)粘模刺激試驗(yàn)

3.1受試物制備

液體受試物以原液未稀釋的形式進(jìn)行試驗(yàn)，膏狀、油狀、粘稠狀、微粒狀或顆粒樣產(chǎn)品以原樣進(jìn)行試驗(yàn)或采用純凈水或玉米油稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，并設(shè)置陽性對照、陰性對照和基準(zhǔn)對照；

3.2粘膜刺激試驗(yàn)

取步驟(1)中制備的受精雞胚，在所述受精雞胚的雞胚尿囊膜上放置特富龍“О”形環(huán)，將受試物、陽性對照、陰性對照和基準(zhǔn)對照分別加入到特富龍“О”形環(huán)，作用后沖洗去除受試物，直接觀察結(jié)果，記錄每種毒性效應(yīng)變化的程度，每次試驗(yàn)6只雞胚，并與環(huán)外血管相比較，血管的變化按照表2進(jìn)行判定和分級，血管反應(yīng)分值在1分和1分以上為血管反應(yīng)陽性；

表2粘膜刺激血管反應(yīng)評分表

(4)預(yù)測模型和分類

4.1結(jié)膜刺激性預(yù)測模型

從濃度-反應(yīng)關(guān)系計(jì)算受試物的RC₅₀，根據(jù)以下條件作出結(jié)膜刺激性判斷：

RC₅₀≥50％，預(yù)測“無刺激性/溫和性”，

10.0％＜RC₅₀且＜50％，預(yù)測“無刺激性”，

3.0％≤RC₅₀且＜10.0％，預(yù)測“弱刺激性”，

1.0％≤RC₅₀且＜3.0％，預(yù)測“中度刺激性”，

RC₅₀＜1.0％，預(yù)測“重度刺激性或腐蝕性”；

4.2口腔粘模刺激性預(yù)測模型

計(jì)算每只雞胚3種反應(yīng)的總評分，再計(jì)算6只雞胚反應(yīng)的平均總評分AES；

根據(jù)以下條件作出口腔粘模刺激判斷：

AES≤6：預(yù)測“無口腔粘膜刺激性”；

6＜AES且≤12：預(yù)測“輕度口腔粘膜刺激性”；

12＜AES且＜16：預(yù)測“中度口腔粘膜刺激性”

AES≥16：預(yù)測“嚴(yán)重口腔粘膜刺激性”。