[發明專利]一種多重PCR檢測三種腹瀉病毒用試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201710365913.7
• 申請日: 2017-05-23
• 公開（公告）號: CN107058632A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 韋玉軍;李航;王娟;蘇軍;吳遠航
• 申請（專利權）人: 安徽安龍基因醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙)33240
• 代理人: 王桂名

技術領域

本發明涉及核酸檢測技術領域，尤其涉及的是一種多重PCR檢測三種腹瀉病毒用試劑盒及其檢測方法。

背景技術

腹瀉是我國的常見病、多發病，感染的病原主要為病毒等，感染者從倦怠﹑乏力﹑低熱等﹐甚至全身感染﹐腦﹑脊髓﹑心﹑肝等重要器官受損﹐可呈現不同的癥狀，預后較差﹐并可遺留后遺癥或造成死亡。因此對腹瀉病原體的快速、準確的診斷十分必要。同時腹瀉病原體的種類繁多，給診斷帶來巨大挑戰。人星狀病毒(Human Astrovirus，HAstV)是引起嬰幼兒、老年人及免疫功能缺陷人群腹瀉的重要病源之一，在全球范圍內廣泛存在，既可引起散發性腹瀉，也可以引起暴發性腹瀉。人腺病毒共有51個血清型，分屬A～F 6個亞組。F組又分為腺病毒40型(Ad40)和41型(Ad41)，稱為腸道腺病毒(Enteric Adenovirus，EAdV)。EAdV是引起全球嬰幼兒急性重癥腹瀉的重要原因，被認為與幼兒園、學校和醫院中散發腹瀉和暴發腹瀉有關。輪狀病毒(Rotavirus，RV)是秋冬季嬰幼兒腹瀉最常見的病原，位居小兒腹瀉第一位(約占40％)。根據病毒外殼抗原可分為A～G 7個不同的組，A組在流行學和疫苗方面最為重要。RV全球范圍廣泛存在。

目前，臨床上常用的腹瀉病原體檢測方法為試紙條法(酶聯免疫吸附法，ELISA)，此法雖然時間短，但是敏感性較低，且受到抗體動力學的影響。熒光核酸PCR技術具有敏感性高，檢測快速等優點，預期將會在臨床診斷中有廣泛的應用。然而，傳統的熒光實時PCR每次只能擴增一種病原體的核酸，要準確找出致病病原體需多次嘗試，耗費大量的時間和精力，并且對于多種病原體導致的感染無法有效區分。新型的多重實時熒光PCR可以有效彌補單重PCR的這些缺陷，是一種非常有應用前景的診斷方法。

中國專利《多重PCR檢測七種腹瀉病毒用引物組和試劑盒及其檢測方法》(文件號CN106191316；公開日2016年12月7日)公開了一種試劑盒及其檢測方法，主要檢測諾瓦病毒G1、諾瓦病毒G2、腺病毒、星狀病毒和輪轉病毒，根據專利文獻所述，5種腸道病原體檢測分為兩個反應，反應一包括諾瓦病毒G1、諾瓦病毒G2和內對照；反應二包括腺病毒、星狀病毒和輪狀病毒。此專利實則進行兩個三聯檢測。然而此專利沒有添加內標，無法對樣本核酸進行控制，另外，此專利將Cy5、FAM和YAK熒光素分別標記腺病毒、星狀病毒和輪狀病毒，而Cy5熒光素本身的熒光值較低，在低濃度時會造成熒光值太低被儀器認為是陰性，從而造成腺病毒的假陰性結果。

要成功實施多重PCR，需要解決幾個技術問題：(1)由于每一種擴增子的最佳擴增條件都不一樣，需要協調每個單獨反應的條件以保證在單一擴增條件下各擴增子都能進行成功擴增。(2)由于需要使用多組引物/探針組合，不同引物/探針之間互相產生交聯的可能性很大，因此在設計時需要考慮消除這一可能性。(3)每組引物/探針不能對其他目標和非目標核酸序列有交叉同源性，以防止產生假陽性的結果，影響對疾病的診斷。(4)需要有一定的方法來排除來自于核酸提取方面的問題，這就要求有內對照作為參考。

發明內容

本發明的目的是解決不同引物/探針之間互相產生交聯的問題，提供了一種腹瀉病毒檢測引物和試劑盒及其檢測方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：一種多重PCR檢測三種腹瀉病毒用試劑盒，試劑盒內設有陽性對照和陰性對照，其特征在于：該試劑盒內還設有用于檢測A組輪狀病毒、星狀病毒和腸道腺病毒中一種或多種病原體的多種引物組及探針序列的混合物。

優選的，用于A組輪狀病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，Taqman探針序列為SEQ ID NO：3，熒光標記為ROX；

用于星狀病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，Taqman探針序列為SEQ ID NO：6，熒光標記為FAM；

用于腸道腺病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，Taqman探針序列為SEQ ID NO：9，熒光標記為HEX；

用于人內標基因檢測的引物序列分別為SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，Taqman探針序列為SEQ ID NO：12，熒光標記為Cy5。