[發明專利]一種多重PCR檢測三種腹瀉病毒用試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201710365913.7
• 申請日: 2017-05-23
• 公開（公告）號: CN107058632A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 韋玉軍;李航;王娟;蘇軍;吳遠航
• 申請（專利權）人: 安徽安龍基因醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙)33240
• 代理人: 王桂名

1.一種多重PCR檢測三種腹瀉病毒用試劑盒，試劑盒內設有陽性對照和陰性對照，其特征在于：該試劑盒內還設有用于檢測A組輪狀病毒、星狀病毒和腸道腺病毒中一種或多種病原體的多種引物組及探針序列的混合物。

2.根據權利要求1所述的一種多重PCR檢測三種腹瀉病毒用試劑盒，其特征在于：用于A組輪狀病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，Taqman探針序列為SEQ ID NO：3，熒光標記為ROX；

用于星狀病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，Taqman探針序列為SEQ ID NO：6，熒光標記為FAM；

用于腸道腺病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，Taqman探針序列為SEQ ID NO：9，熒光標記為HEX；

用于人內標基因檢測的引物序列分別為SEQ ID NO：10和SEQID NO：11，Taqman探針序列為SEQ ID NO：12，熒光標記為Cy5。

3.根據權利要求1所述的一種多重PCR檢測三種腹瀉病毒用試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括PCR擴增試劑和對照試劑，所述PCR擴增試劑包括PCR反應緩沖液、HAstV/EAdV/RV引物探針混合液和酶系，所述對照試劑包括陰性對照和HAstV/EAdV/RV陽性對照，所述陰性對照為細胞培養液，所述陽性對照為含HAstV、EAdV和RV目的基因片段的質粒菌。

4.根據權利要求3所述的一種多重PCR檢測三種腹瀉病毒用試劑盒，其特征在于：所述PCR反應緩沖液包括5×RT-PCR buffer和dNTPs，所述HAstV/EAdV/RV引物探針混合液為HAstV/EAdV/RV、內標引物和探針，所述酶系包括DNA聚合酶、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑。

5.三種腹瀉病毒的檢測方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

1)按下列組成配制PCR反應液(n為反應管數)

PCR反應緩沖液1為16μl×n，HAstV/EAdV/RV引物探針混合液為2μl×n，酶系2為2μl×n；(注意：使用前確保PCR反應緩沖液、HAstV/EAdV/RV引物探針混合液充分溶解并混勻，酶系在使用前需離心以確保所有酶集中在底部)

2)將反應體系按20μl/管分裝至PCR反應管中，將裝有PCR反應液的反應管移至樣本處理區；

3)加樣(在樣本處理區進行)，用帶濾芯的吸嘴分別取已處理好的樣本、陰性對照、陽性對照上清各5μl分別加到裝有PCR反應液的PCR反應管中，蓋上管蓋，離心數秒后移至擴增檢測區；

4)熒光定量PCR擴增(在擴增檢測區進行)，將PCR反應管放入熒光PCR擴增儀中進行擴增檢測。

6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于：步驟1)的引物的最終使用濃度為0.2uM，探針的最終使用濃度為0.1uM。

7.根據權利要求5或6任意所述的檢測方法，其特征在于：步驟4)的反應條件包括如下a-g的程序：

a：50℃保持25min(逆轉錄)；

b：95℃保持5min(熱啟動)；

c：95℃維持10s(變性)；

d：55℃維持15s(退火)；

e：72℃維持30s(延伸)，進行5個循環(預擴增)；

f：95℃維持10s(變性)；

g：60℃維持45s(退火/延伸，采集熒光信號)，進行40個循環。