[發明專利]一種利用雞胚血管系統檢測和評價個人護理產品和原料光毒性的方法

在審

• 申請號: 201710364893.1
• 申請日: 2017-05-22
• 公開（公告）號: CN107418997A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 程樹軍;秦瑤
• 申請（專利權）人: 程樹軍;廣州市華代生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司44104
• 代理人: 周克佑

1.一種利用雞胚血管系統檢測和評價個人護理產品和原料光毒性的方法，其特征是包含以下步驟：

(1)雞胚卵黃囊血管膜制備

選取SPF級受精雞胚，制備具有卵黃囊血管膜的受精雞胚備用；

(2)光劑量確定實驗

取步驟(1)中制備獲得的雞胚，在三個光照劑量強度下照射后，觀察卵黃囊血管膜、胚胎發育的變化，將無毒性的光照劑量用于后續刺激性RC₅₀確定試驗和光刺激性RC₅₀確定試驗；

(3)受試物制備

選取受試物，用溶劑溶解后，在無血管反應的受試物最高濃度以下，配制一組具有濃度梯度的稀釋液，備用，并設置陽性對照和陰性對照；

(4)光毒性實驗

1)預試驗

取步驟(3)中配制的一組具有濃度梯度的稀釋液、陽性對照和陰性對照，分別加入到步驟(1)中制備的雞胚的卵黃囊血管膜上，恒溫培養箱孵育后，觀察血管、胚胎存活變化，并與陽性對照和陰性對照相比較，血管的變化按照下表1進行判定和分級，血管反應分級在2分以上者為血管反應陽性；

2)無光刺激性RC_50UV-確定試驗

選取受試物，用溶劑溶解后，在無血管反應的受試物最高濃度以下，選擇比預實驗更小的稀釋因子，重新配制一組具有濃度梯度的稀釋液，將該組稀釋液、陽性對照和陰性對照，無光照條件下分別加入到步驟(1)中制備的雞胚的卵黃囊血管膜上，恒溫培養箱孵育后，觀察血管、胚胎存活變化，并與陽性對照和陰性對照相比較，血管的變化按照下表1進行判定和分級，血管反應分級在2級以上者為血管反應陽性，按對數圖計算刺激性RC₅₀的值，簡稱RC_50UV-，即在無光照射條件下使半數雞胚出現陽性反應的受試物濃度；

3)光刺激性RC_50UV+確定試驗

選取受試物，用溶劑溶解后，在無血管反應的受試物最高濃度以下，選擇高于RC_50UV-的一個稀釋濃度開始，采用相同的稀釋因子制備一組具有濃度梯度的稀釋液，將該組稀釋液、陽性對照和陰性對照，在光照條件下分別加入到步驟(1)中制備的雞胚的卵黃囊血管膜上，恒溫培養箱孵育后，觀察血管、胚胎存活變化，并與陽性對照和陰性對照相比較，血管的變化按照下表1進行判定和分級，血管反應分級在2級及其以上者為血管反應陽性，按對數圖計算光刺激性RC₅₀的值，簡稱RC_50UV+，即在有光照射條件下使半數雞胚出現陽性反應的受試物濃度；

表1 光毒性的血管反應觀察及分級

分級觀察描述0觀察不到血管褪色或者出血，血管膜正常1血管白色無血液，管壁清晰；或/和毛細血管充血2毛細胞血管可見細小出血點，出血面積＜20％3明顯的血管出血，散在或出血區域＞20％，＜50％4嚴重出血，出血區域超過50％

(5)光刺激預測模型和判斷

按以下公式計算光刺激指數PII＝RC_50UV-/RC_50UV+，從濃度-反應關系計算有光照RC_50UV+和無光照片情況下的RC_50UV-；

根據上述預測模型得出的光刺激指數，根據以下條件作出光刺激判斷：

PII＜2：預測“無光毒性”；

2≤PII且PIF＜5：預測“可能具有光毒性”；

PIF≥5，預測“光毒性”。