[發明專利]一種用于檢測雌激素受體的快速檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201710364329.X
• 申請日: 2017-05-22
• 公開（公告）號: CN106970227B
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發明（設計）人: 陳立國;鄒偉權;張亞麗;李慶祥;母潤紅;王濤;蘇焱
• 申請（專利權）人: 上海拜譜生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 鄭海松

1.一種用于檢測雌激素受體的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括雌激素受體標準品，雌激素受體質控品，濃縮洗滌液，發光底物溶液Ⅰ，發光底物溶液Ⅱ，抗試劑和磁珠免疫復合物；

所述磁珠免疫復合物的制備包括以下步驟：

取100μL濃度為10mg/mL的鏈霉親和素磁珠，用250μL濃縮洗滌液按照1∶100稀釋得到的溶液洗滌3～5次，加入40μL生物素化雌激素受體單克隆抗體，置于37℃恒溫氣浴搖床中振蕩，振蕩速度為120r/min，8～20min后取出，用200μL濃縮洗滌液按照1∶100稀釋得到的溶液洗滌4次，然后，重新置于上述恒溫氣浴搖床中，加入1mL含體積分數為2％BSA的pH為7.4，濃度為1M的磷酸鹽緩沖液進行封閉反應，封閉反應時間為10～25min，取出，磁性分離，去上清，用200μL濃縮洗滌液按照1∶100稀釋得到的溶液洗滌4次，加入pH為7.4，濃度為1M的磷酸鹽緩沖液配成1mg/mL的磁珠免疫復合物，置于4℃避光保存，即得；

其中，所述濃縮洗滌液的制備方法為：向pH為7.4，濃度為1M的磷酸鹽緩沖液中加入Tween-20，使Tween-20的體積分數為5％；

所述生物素化雌激素受體單克隆抗體的制備包括以下步驟：

1.1取雌激素受體單克隆抗體，用濃度為0.05mol/L，pH為9.5的碳酸鹽緩沖溶液調整雌激素受體單克隆抗體的濃度為1mg/mL，得溶液Ⅰ；

1.2 將生物素、二環己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺溶于二甲基甲酰胺中，生物素、二環己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1∶1∶1.2，于50℃水浴中磁力攪拌反應，反應時間為12h，濾去反應液中生成的白色沉淀二環己基脲，收集濾液，加入乙醚至沉淀不再增加，置于冰浴中，放置時間為1h，過濾收集沉淀，得活性生物素酯粗品，將上述活性生物素酯粗品用熱異丙醇溶解，置于冰浴中，放置時間為3h，過濾收集結晶，用二甲基甲酰胺溶解后加入乙醚，置于冰浴中，放置時間為1h，過濾收集沉淀，真空干燥，得活性生物素酯；

1.3向步驟1.1所得溶液Ⅰ中加入步驟B所得活性生物素酯，活性生物素酯與雌激素受體單克隆抗體的摩爾比為8～15∶1，室溫反應，反應時間為20～40min，得反應液；

1.4將步驟1.3所得反應液移至截留分子量為7000～10000的透析袋內，用濃度為0.05mol/L，pH為9.5的碳酸鹽緩沖溶液透析24h，加入與上述反應液等體積的甘油，置-25℃保存，即得；

所述鏈霉親和素磁珠的制備包括以下步驟：

2.1 配制pH為7.0，濃度為0.1M的磷酸鹽緩沖液，滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時間為15min，將1mg的鏈霉親和素溶于1mL上述磷酸鹽緩沖液中，得鏈霉親和素溶液，取200μL上述鏈霉親和素溶液裝于EP管中；

2.2 取2.5mL氨基化磁性微球，加入2mL戊二醛，室溫震蕩反應，反應時間為5h，進行磁分離，用水清洗除去多余的戊二醛后，將磁性微球重新懸浮在2.5mLpH為7.0，濃度為0.1M的磷酸鹽緩沖液中，得磁性微球液；

2.3 將步驟2.2所得磁性微球液加入到步驟2.1裝有200μL鏈霉親和素溶液的EP管中，室溫震蕩培養5h，磁分離，得固體物，將所得固體物分散在5mL pH為7.0，濃度為0.1M的磷酸鹽緩沖液中，使濃度至10mg/mL，得鏈霉親和素磁珠；

所述步驟2.2中氨基化磁性微球的制備包括以下步驟：

3.1 取0.05g四氧化三鐵磁性納米微球，加入2mL蒸餾水和10mL乙醇，磁力攪拌，加熱升溫至75℃，加入25μL甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨，反應5h后，降溫至60℃，加入30μL氨水，30min后加入20μL正硅酸乙酯，反應2h后，降至室溫，用乙醇和水進行洗滌，磁分離，得表面包覆二氧化硅的四氧化三鐵磁性微球；

3.2 向步驟3.1所得表面包覆二氧化硅的四氧化三鐵磁性微球中，加入10mL乙醇和2mL水，超聲，超聲時間為1min，磁力攪拌，攪拌30分鐘后，加入100μL氨水，繼續攪拌，攪拌15分鐘后，加入50μL氨丙基三甲氧基硅烷，反應5h后，用乙醇與水洗滌，磁分離，直至PH試紙檢測到上清液為中性，得固體物，向所得固體物中加入pH為7.0，濃度為0.1M的磷酸鹽緩沖液，使濃度至20mg/mL，得氨基化磁性微球；

所述抗試劑的制備包括以下步驟：

4.1 取雌激素受體單克隆抗體，用濃度為0.05mol/L，pH為9.5的碳酸鹽緩沖溶液調整雌激素受體單克隆抗體的濃度為1mg/mL，得溶液A；

4.2 取吖啶酯，加入二甲基甲酰胺使吖啶酯的濃度至2mg/mL，得溶液B；

4.3 將步驟4.2所得溶液B加入到步驟4.1所得溶液A中，吖啶酯與雌激素受體單克隆抗體的摩爾比為15～25∶1，室溫反應，反應時間為20～40min，得反應液；

4.4將步驟4.3所得反應液移至截留分子量為7000～10000的透析袋內，用濃度為0.05mol/L，pH為9.5的碳酸鹽緩沖溶液透析24h，加入與上述反應液等體積的甘油，置-25℃保存，即得。