[發(fā)明專利]一種利用離體動(dòng)物角膜模型多參數(shù)檢測眼刺激性的方法

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• 申請日: 2017-05-22
• 公開（公告）號: CN107245509A
• 公開（公告）日: 2017-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程樹軍;秦瑤;黃健聰
• 申請（專利權(quán)）人: 程樹軍;廣州市華代生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司44104
• 代理人: 周克佑

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用離體動(dòng)物角膜模型多參數(shù)檢測眼刺激性的方法。

背景技術(shù)

人類的眼睛可能會接觸到化妝品、藥品、農(nóng)藥和環(huán)境污染物等一種或多種物質(zhì)，對這些外源物質(zhì)的主觀接觸或意外暴露可能造成人群的健康風(fēng)險(xiǎn)。因此，評估可能接觸物質(zhì)的潛在眼刺激性對保障人群健康具有重要意義。19世紀(jì)30年代，由于允許未經(jīng)檢測含有對苯二胺的睫毛產(chǎn)品在美國市場售賣，導(dǎo)致消費(fèi)者使用此類產(chǎn)品引起眼部過敏、角膜潰瘍和失明等不良反應(yīng)。這一公共危害事件促使美國食品藥品和化妝品監(jiān)督管理局(FDA)在1938年采取行動(dòng)，強(qiáng)制要求檢測眼部接觸產(chǎn)品的安全性。

對于眼刺激性的毒理學(xué)評價(jià)，金標(biāo)準(zhǔn)采用的是1944年Draize提出的兔眼刺激體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。一直以來，雖然兔眼實(shí)驗(yàn)被認(rèn)為是評估眼刺激或腐蝕性的唯一標(biāo)準(zhǔn)方法，但其科學(xué)性和合理性備受質(zhì)疑。傳統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)包括：方法的主觀性、動(dòng)物與人體反應(yīng)的差異、周期長、通量低、使用活體動(dòng)物造成動(dòng)物痛苦死亡等。隨著國際動(dòng)物福利運(yùn)動(dòng)的興起和新技術(shù)的發(fā)展，50多年前國外最先提出了以"減少(reduction)"、"替代(replacement)"和"優(yōu)化(refinement)"為核心內(nèi)容的“3R 原則”，并在此基礎(chǔ)上大力開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法的研究。特別是近20年，以體外替代技術(shù)為核心的試驗(yàn)方法，逐漸被許多國家和地區(qū)的監(jiān)管部門所接收和認(rèn)可。如歐盟化妝品指令《2003/15/EC》和法規(guī)《1223/2009/EC》對于化妝品動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的禁止，歐盟新化學(xué)品法規(guī)REACH(化學(xué)品的注冊、評估、許可和限制)鼓勵(lì)動(dòng)物試驗(yàn)替代方法的開發(fā)和應(yīng)用。美國替代方法研究評價(jià)中心(ICCVAM) 提出的一系列非動(dòng)物測試方法等。全球范圍內(nèi)多個(gè)地區(qū)和國家通過法規(guī)禁止/部分禁止或限制動(dòng)物試驗(yàn)的進(jìn)行。尤其是在化妝品領(lǐng)域，2013年歐盟范圍內(nèi)全面禁止銷售從原料到成品經(jīng)過動(dòng)物試驗(yàn)的化妝品。用非活體動(dòng)物的試驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行眼刺激性評價(jià)是動(dòng)物試驗(yàn)替代技術(shù)的關(guān)鍵領(lǐng)域之一。

體外替代試驗(yàn)是根據(jù)體內(nèi)眼損傷發(fā)生的機(jī)理開發(fā)的，目前開發(fā)中的眼刺激替代方法，其實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可分為細(xì)胞系統(tǒng)、器官型系統(tǒng)、人工角膜等，其中，器官型系統(tǒng)主要有雞胚絨毛膜尿囊膜和離體角膜。離體角膜來源于廢棄的動(dòng)物眼球組織，不需要額外動(dòng)物來源，天然角膜與人體角膜接近，離體角膜在短期內(nèi)可以維持正常生理活性，可以模擬人角膜暴露。牛角膜渾濁度滲透性試驗(yàn)(TG 437) 經(jīng)過OECD認(rèn)可，作為替代傳統(tǒng)動(dòng)物試驗(yàn)評價(jià)急性眼刺激性的方法之一，用于分類和標(biāo)示，其數(shù)據(jù)廣泛被接受。然而實(shí)際中可能接觸到多種外源化學(xué)物，且重復(fù)接觸，例如藥物、大氣污染物等，國際上尚未認(rèn)可多次眼刺激性體外方法。目前基于離體角膜的多參數(shù)重復(fù)暴露眼刺激性體外預(yù)測/評價(jià)方法未見相關(guān)專利和文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題，就是提供一種利用離體動(dòng)物角膜模型多參數(shù)檢測眼刺激性的方法，該方法具有快速、通量高、不使用活體動(dòng)物等優(yōu)點(diǎn)，可以對一種/多種物質(zhì)多重/多次暴露眼刺激性進(jìn)行快速評價(jià)/預(yù)測，且能廣泛應(yīng)用。

解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

一種利用離體動(dòng)物角膜模型多參數(shù)檢測眼刺激性的方法，其特征是含以下步驟：

S1，離體動(dòng)物眼球的獲取

S1-1，離體動(dòng)物眼球來源于動(dòng)物屠宰場，眼球的摘取應(yīng)在動(dòng)物死亡4h內(nèi)進(jìn)行；

S1-2，采用剪刀或類似器械從眼眶進(jìn)入，切斷與眼球連接的組織，完整取處眼球，摘取眼球的過程中不能接觸或損傷眼球組織及眼球表面的角膜；

S1-3，將摘取下的眼球完全浸泡于含100IU/mL青霉素和100IU/mL鏈霉素、且4℃預(yù)冷的無菌 HBSS緩沖液，于7h內(nèi)進(jìn)行檢測；

S2，離體角膜的制備

S2-1，離體角膜指健康動(dòng)物離體眼球分離的角膜，無肉眼可見的損傷或病變；

S2-2，分離角膜前肉眼檢查角膜完整性，丟棄有劃痕、色素沉著、白班、混濁、機(jī)械損傷或異常者；

S2-3，源于牛眼球的角膜直接分離，豬眼球應(yīng)浸入含1％的聚維酮碘溶液2min，用無菌PBS沖洗，浸入含有0.1％慶大霉素的PBS 15min消毒后進(jìn)行角膜分離操作；

S2-4，角膜分離應(yīng)在潔凈的環(huán)境下進(jìn)行，紫外燈照射房間至少30min；

S2-5，角膜外周保留2-3mm鞏膜，以手術(shù)刀做切口，環(huán)切下角膜，夾住鞏膜，用鑷子剝除角膜內(nèi)皮的玻璃體和虹膜附屬組織，操作中不得直接接觸角膜上皮或內(nèi)皮組織；

S2-6，將角膜內(nèi)皮朝上置于無菌32±1℃預(yù)熱HBSS緩沖液中清洗1-2次，去除附屬殘留組織；