[發(fā)明專(zhuān)利]一種利用離體動(dòng)物角膜模型多參數(shù)檢測(cè)眼刺激性的方法

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• 申請(qǐng)日: 2017-05-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107245509A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程樹(shù)軍;秦瑤;黃健聰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 程樹(shù)軍;廣州市華代生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/02
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/02
• 代理公司: 廣州知友專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司44104
• 代理人: 周克佑

1.一種利用離體動(dòng)物角膜模型多參數(shù)檢測(cè)眼刺激性的方法，其特征是包括以下步驟：

S1，離體動(dòng)物眼球的獲取

S1-1，離體動(dòng)物眼球來(lái)源于動(dòng)物屠宰場(chǎng)，眼球的摘取應(yīng)在動(dòng)物死亡4h內(nèi)進(jìn)行；

S1-2，采用剪刀或類(lèi)似器械從眼眶進(jìn)入，切斷與眼球連接的組織，完整取處眼球，摘取眼球的過(guò)程中不能接觸或損傷眼球組織及眼球表面的角膜；

S1-3，將摘取下的眼球完全浸泡于含100IU/mL青霉素和100IU/mL鏈霉素、且4℃預(yù)冷的無(wú)菌HBSS緩沖液，于7h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)；

S2，離體角膜的制備

S2-1，離體角膜指健康動(dòng)物離體眼球分離的角膜，無(wú)肉眼可見(jiàn)的損傷或病變；

S2-2，分離角膜前肉眼檢查角膜完整性，丟棄有劃痕、色素沉著、白班、混濁、機(jī)械損傷或異常者；

S2-3，源于牛眼球的角膜直接分離，豬眼球應(yīng)浸入含1％的聚維酮碘溶液2min，用無(wú)菌PBS沖洗，浸入含有0.1％慶大霉素的PBS 15min消毒后進(jìn)行角膜分離操作；

S2-4，角膜分離應(yīng)在潔凈的環(huán)境下進(jìn)行，紫外燈照射房間至少30min；

S2-5，角膜外周保留2-3mm鞏膜，以手術(shù)刀做切口，環(huán)切下角膜，夾住鞏膜，用鑷子剝除角膜內(nèi)皮的玻璃體和虹膜附屬組織，操作中不得直接接觸角膜上皮或內(nèi)皮組織；

S2-6，將角膜內(nèi)皮朝上置于無(wú)菌32±1℃預(yù)熱HBSS緩沖液中清洗1-2次，去除附屬殘留組織；

S2-7，將角膜上皮朝上，放置于角膜固定器的后室部分；穩(wěn)定放上前室部分，以螺絲固定前后室，期間避免移動(dòng)前室，以免造成角膜損傷；

S2-8，角膜固定器的后室和前室分別依次填充無(wú)菌不含酚紅的MEM培養(yǎng)基，水平置于32±1℃，RH70±10％的培養(yǎng)箱中孵育1～2h，以恢復(fù)角膜正常生理活性；

S3，受試物和對(duì)照組暴露

S3-1，角膜孵育后，更換前后室培養(yǎng)基，依前后室順序?qū)⒁后w抽出，依次向后室和前室重新加入新鮮培養(yǎng)基，用角膜濁度儀測(cè)量并記錄每個(gè)角膜初始濁度值，根據(jù)濁度值進(jìn)行角膜分組；

S3-2，每個(gè)角膜加入1±0.5ml(g)受試物，并確保受試物完全覆蓋角膜；液體受試物直接從前室上方小孔加入，粘稠或固體受試物打開(kāi)前室玻璃片，將受試物加入角膜表面；

S3-3，多參數(shù)暴露條件：根據(jù)受試物的不同，選擇不同的暴露參數(shù)，所有陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和溶劑對(duì)照均采用與受試物相同的暴露條件；

S3-4，豎直放置角膜固定器，使受試物與角膜充分接觸，返回培養(yǎng)箱暴露；暴露結(jié)束后進(jìn)行沖洗，以完全去除受試物，沖洗之后返回培養(yǎng)箱進(jìn)行后孵育，后孵育結(jié)束后更換前后室培養(yǎng)基，再次測(cè)量并記錄每個(gè)相應(yīng)的角膜濁度值；

S4，收集后室培養(yǎng)基，保存用于酶活性和/或炎性因子測(cè)定；

S5，去除前室培養(yǎng)基，加入1ml熒光素鈉溶液，繼續(xù)孵育90分鐘；收集后室所有液體，混勻后取液體360μL在490nm波長(zhǎng)下讀取吸光度值；

S6，評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)量

A.肉眼觀察，受試物暴露后，觀察角膜顏色、狀態(tài)或有無(wú)上皮脫落，記錄并作為附加評(píng)價(jià)的參考；

B.渾濁度(OP值)，角膜在受試物暴露前和暴露后濁度的變化，反應(yīng)受試物對(duì)角膜的刺激性；

C.滲透性(DO₄₉₀)，受試物暴露后，通過(guò)熒光素鈉定量，評(píng)估角膜上皮完整性；

D.炎性物質(zhì)的釋放，LDH活性、IL-6或IL-8等細(xì)胞因子定量檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)炎性物質(zhì)含量，并與做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用于樣品精細(xì)分析；

E.組織學(xué)檢測(cè)，完成試驗(yàn)后的角膜固定在固定液中，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估，作為附加評(píng)價(jià)參考。

S7，預(yù)測(cè)模型

1)角膜體外評(píng)分＝校正OP值+15×校正OD₄₉₀

2)細(xì)分類(lèi)模型：組織學(xué)評(píng)分，炎性物質(zhì)釋放

刺激性體外評(píng)分 刺激性預(yù)測(cè) ≤3 無(wú)刺激性 ＞3，≤15 微弱刺激性 ＞15，≤55 輕刺激性 ＞55 嚴(yán)重刺激性/腐蝕性

所有上述步驟中，涉及的所有操作器械經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理，所有的培養(yǎng)、暴露和孵育均處于無(wú)菌培養(yǎng)箱中，溫度為32±1℃，濕度70±10％。