[發明專利]一種多肽疫苗的篩選評估方法

有效

• 申請號: 201710363857.3
• 申請日: 2017-05-22
• 公開（公告）號: CN107247132B
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 劉倩;陸小梅;彭琪;蔣再學;謝明玉
• 申請（專利權）人: 東莞市兒童醫院;東莞市兒科研究所
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;C07K14/085;C07K1/22
• 代理公司: 東莞市華南專利商標事務所有限公司 44215
• 代理人: 姜華

1.一種用于非治療目的的多肽疫苗的篩選評估方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)多肽序列的選擇：選擇病原體中和抗原表位多肽序列作為多肽疫苗的序列；

(2)中和抗原表位多肽的合成：將選定的中和抗原表位進行多肽合成，封閉活性基團；

(3)多肽與偶聯載體偶聯：將多肽與偶聯載體進行偶聯，洗脫未偶聯的多肽，封閉未偶聯的偶聯載體，清洗待用；

(4)親和層析：將偶聯多肽后的偶聯載體裝填至蛋白質純化柱，加入抗體樣本，洗脫并收集中和抗體；

(5)中和抗體分析：通過體外微量中和試驗的方法，分析捕獲的中和抗體的中和滴度；

其中，所述步驟(1)具體為：選擇EV71病毒C4流行株中和抗原表位SP55、SP70和VP2-28多肽序列作為多肽疫苗的序列；

其中，所述步驟(1)中，EV71病毒C4流行株中和抗原表位SP55、SP70和VP2-28多肽序列分別為：

SP55：PDSRESLAWQTATNP

SP70：YPTFGEHKQEKDLEY

VP2-28：AGGTGTEDTHPPYKQ；

其中，所述步驟(3)包括如下步驟：

(3.1)偶聯載體預處理：選擇瓊脂糖珠作為偶聯載體，加入雙蒸水進行膨脹，再加入雙蒸水進行洗滌；

(3.2)偶聯配基：

(3.2.1)配基溶解：將多肽用質量分數為25％、pH為9.0的二甲基甲酰胺溶解；

(3.2.2)偶聯：將預處理后的瓊脂糖珠和溶解后的多肽按體積比0.8-1.2:1的比例混合，在20-40℃溫度下孵育14-18h；

(3.2.3)洗脫：用質量分數為25％、pH為9.0的二甲基甲酰胺洗脫未偶聯的多肽；

(3.2.4)封閉：在20-40℃溫度下，將洗脫后的瓊脂糖珠靜置于0.8-1.2mol/L的乙醇胺中3-5h，封閉未偶聯的偶聯載體；

(3.2.5)清洗：用摩爾濃度為0.1mol/L、pH為4.0的醋酸鹽緩沖液加0.4-0.6mol/L的NaCl溶液和pH為8.0的tris-HCl緩沖液加摩爾濃度為0.4-0.6mol/L的NaCl溶液循環清洗瓊脂糖珠；

其中，所述步驟(4)包括如下步驟：

(4.1)結合：將偶聯多肽后的偶聯載體裝填至蛋白質純化柱，以丙種球蛋白作為抗體樣本，加入純化柱中，加入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌；

(4.2)洗脫：用摩爾濃度為0.1mol/L、pH為4.0的檸檬酸緩沖液洗脫抗體，于收集管中加入0.4-0.6gTris固體試劑；

(4.3)收集：重復步驟(4.1)和步驟(4.2)，直至收集足夠量的抗體；

(4.4)平衡：用10K的蛋白超濾管加入13-17mLPBS平衡，在4500-5500rpm轉速下離心25-35min，棄掉廢液；

(4.5)濃縮去鹽：將步驟(4.3)收集的抗體加入蛋白超濾管中，在4500-5500rpm轉速下離心25-35min，收集超濾膜上方液體為濃縮去鹽抗體；重復該步驟，直至全部抗體濃縮去鹽；其中，所述步驟(5)包括如下步驟：

(5.1)病毒TCID50的計算：將Vero細胞接種至96孔板，然后接種EV71病毒，接種7天后觀察細胞病變情況，計算EV71病毒的TCID50；

(5.2)體外微量中和實驗通過體外微量中和試驗的方法，分析捕獲的中和抗體的中和滴度。