[發明專利]一種檢測核酸外切酶I的熒光傳感方法

有效

• 申請號: 201710363009.2
• 申請日: 2017-05-08
• 公開（公告）號: CN107192697B
• 公開（公告）日: 2019-09-27
• 發明（設計）人: 胡宇芳;張青青;杜春暖;王嬌;饒家佳;郭智勇;葛國平;王邃
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種檢測核酸外切酶I(Exo I)的熒光傳感方法，特點是具體步驟如下：(1)將陽離子共軛聚合物(CCP)與銥配合物混合，然后加入Exo I緩沖液，得到用于檢測Exo I的基于CCP與銥配合物熒光共振能量轉移(FRET)效應的熒光傳感器體系。檢測熒光強度；(2)加入單鏈DNA(ssDNA)到步驟(1)中的體系，檢測熒光強度的變化；(3)不同濃度的Exo I加入到步驟(2)中，檢測樣品中Exo I的活性，優點是第一次發明了一種特異性好、靈敏度高、檢測速度快，結果準確可靠的分析傳感方法用于Exo I的檢測。

技術領域

本發明涉及熒光生物傳感器，尤其是涉及一種檢測核酸外切酶I(Exo I)的熒光傳感方法。

背景技術

核酸外切酶(Exonucleases)是一類從多核苷酸鏈的一頭開始按序催化降解核苷酸的酶。核酸外切酶分為：核酸外切酶I(Exo I)和核酸外切酶III(Exo III)。Exo I是一種僅能從單鏈DNA(ssDNA)的3’端到5’端，按照堿基順序，逐個催化水解堿基間的磷酸二酯鍵，逐漸降解ssDNA的酶。Exo I水解ssDNA后，最終產物是逐個脫氧核糖核苷酸。Exo I對ssDNA的堿基序列是沒有要求的，不具有水解雙鏈DNA的能力。核酸外切酶在生物學的很多過程中起著重要的作用，如DNA復制、重組、修復等。其中最重要的功能就是維持生物體內的基因突變幾率，從而維持遺傳信息的穩定性。近年來，相繼報道了Exo III的定量檢測，然而Exo I的研究還很少。

目前對Exo I的活性檢測普遍缺乏定量描述，因為傳統檢測Exo I活性的方法是將標準的DNA與核酸外切酶反應，凝膠電泳觀察酶切效果，這種方法最多給出半定量結果，而且操作麻煩、重現性差，更不能實時給出不同條件下的酶活性變化。因此，發展一種快速、準確、靈敏的定量檢測Exo I活性的方法，將有重要價值。

銥配合物具有發光效率高、較大的Stokes位移、發光顏色可以通過改變配體結構進行調節以及良好的光穩定性等優點而成為研究的熱點。根據報道，銥配合物在生物傳感器方面的應用越來越廣泛。陽離子共軛聚合物(CCP)作為一種新型的水溶性熒光分子，具有摩爾吸光系數大、熒光量子產率高等優點。同時，共軛聚合物具有分子導線的功能，能夠實現熒光信號的放大。銥配合物和CCP可以發生熒光共振能量轉移(FRET)現象。

本發明基于銥配合物和CCP的FRET現象，構建一種簡單、高靈敏、快速的分析傳感方法，用于定量檢測Exo I，過程及其簡單，為臨床應用提供了一種很有前景的檢測手段。目前，基于銥配合物和CCP的FRET現象檢測Exo I活性的熒光傳感器尚未見報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種特異性好、靈敏度高、檢測速度快、結果準確可靠的檢測Exo I的熒光傳感方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種檢測Exo I的熒光傳感方法，具體步驟如下：

(1)將85～95μL濃度為3～4μM CCP與0.5～2μL濃度為0.5～2mM銥配合物混合，然后加入相應體積的10×Exo I緩沖液，得到100μL用于檢測Exo I的基于CCP與銥配合物FRET效應的熒光傳感器體系。檢測熒光強度，計算CCP(415nm)的熒光強度與銥配合物(530nm)的熒光強度比值。

(2)加入1～3μL 5～15μM的ssDNA到步驟(1)中的體系，檢測熒光強度的變化，計算CCP(415nm)的熒光強度與銥配合物(530nm)的熒光強度比值。

(3)不同濃度的Exo I加入到步驟(2)中，然后加入相應體積的10×Exo I緩沖液，30～40℃下溫育25～35min，檢測熒光強度的變化，計算CCP(415nm)的熒光強度與銥配合物(530nm)的熒光強度比值，獲得一系列不同濃度的Exo I對應的熒光強度比值，建立熒光強度比值與Exo I濃度之間的定量關系；根據這個定量關系可以檢測樣品中Exo I的活性。