[發明專利]用于植物基因表達載體構建的質粒載體及其應用

在審

• 申請號: 201710360919.5
• 申請日: 2017-05-13
• 公開（公告）號: CN107099550A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 安韶雅;虎娟;周濤;林哲;張虹;陳任
• 申請（專利權）人: 寧夏大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及植物基因領域，具體涉及一種用于植物基因表達載體構建的質粒載體及其應用。

背景技術

植物基因工程技術的迅速發展和廣泛應用為植物的遺傳改良開拓了廣闊的前景。該技術克服了植物有性雜交的限制，可將來源于不同物種甚至人工合成的基因導入植物，從而改良植物性狀，培育優質高產作物新品種。在植物基因克隆、基因功能分析以及基因轉化等分子生物學的研究與應用過程中，需要構建植物基因表達載體。但是，目前常用于植物基因表達載體構建的質粒，如pBIN19(Bevan，1984)、pBI121(Jefferson，1987)、pIG121-Hm(Ohta et al.，1999)、pMSIsGFP(Kawasaki et al.，1999)等，由于其T-DNA領域中限制性內切酶位點有限，目的基因難于插入和連接，而且目的基因在植物體內表達還需要啟動子、終止子、篩選標記等功能元件，需要構建多個中間載體，操作比較麻煩。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種用于植物基因表達載體構建的質粒載體pNULPGE200及其應用方法。經PCR等方法克隆得到的目的基因可以多種方式很方便地連接到該質粒載體的35S啟動子與NOS終止子之間的多個克隆酶切位點MCS，使目的基因能夠在植物體內穩定表達，該質粒載體還具有獨立表達的卡那霉素NPT II耐性基因和sGFP綠色熒光蛋白報告基因，能夠顯著提高轉基因植物細胞的選拔效果。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

利用現有的經大腸桿菌(Escherichia coli)質粒pUC18(Yanisch-Perron et al.，1985)改造的pKAFCR1和經雙核農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti(tumer inducing)質粒pBI121改造的pKAFCR100兩種質粒，在pKAFCR1的35S啟動子(cauliflower mosaic virus 35S promoter)和NOS終止子(nopaline synthase terminator)之間，引入多個克隆酶切位點MCS(multiple cloning site)。然后將包含35S-MCS-NOS片段切下連接到pKAFCR100，使其成為一個用于構建植物基因表達的質粒載體pNULPGE200；目的基因可以多種方式很方便地連接到該質粒載體的35S啟動子與NOS終止子之間的多個克隆酶切位點MCS。

質粒載體pNULPGE200的構建，包括如下步驟：

S1、在pKAFCR1質粒(圖1)的35S啟動子和NOS終止子之間引入多克隆酶切位點MCS

S11、利用限制性內切酶Xba I和Sac I，對pKAFCR1質粒進行雙酶切處理，切除其原有的Xba I到Sac I部分；

S12、將雙酶切后的pKAFCR1經1％的瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取目的條帶，通過常規的凝膠回收方法或凝膠回收試劑盒(如QIAGEN Q IAqui ck Gel Extraction Kit)獲得已切除Xba I和Sac I部分的pKAFCR1；

S13、人工合成以下兩條單鏈DNA：

CR1MCSin-S：

5’-CTAGAGTTAACTTAATTAACCCGGGAGGCCTGGTACCCTCGAGGAGCT-3’；

CR1 MCS in-A：

5’-CCTCGAGGGTACCAGGCCTCCCGGGTTAATTAAGTTAACT-3’；

然后采用溫度梯度退火法，使兩條單鏈DNA構成一條雙鏈DNA雙鏈，該片段含有Xba I、Hpa I、Pac I、Xma I(Sma I)、Stu I、Kpn I、Xho I和Sac I等多個克隆酶切位點MCS；反應條件為94℃ 3sec，95℃ 5min，95℃至25℃溫度梯度0.1℃/seC，25℃ 15min；

S14、利用T4-DNA連接酶或質粒連接用試劑盒(如TOYOBO Ligation High Kit)將已切除Xba I和Sac I部分的pKAFCR1與人工合成DNA片段進行連接，連接后的重組質粒利用熱激法轉化到大腸桿菌DH5α菌株的感受態細胞中；

S15、將轉化后的大腸桿菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固體培養基上培養，挑取單獨菌落進行菌落PCR鑒定，篩選含有MCS重組質粒的陽性菌落；