[發明專利]用于植物基因表達載體構建的質粒載體及其應用

在審

• 申請號: 201710360919.5
• 申請日: 2017-05-13
• 公開（公告）號: CN107099550A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 安韶雅;虎娟;周濤;林哲;張虹;陳任
• 申請（專利權）人: 寧夏大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于植物基因表達載體構建的質粒載體pNULPGE200，其特征在于，經PCR克隆得到的目的基因可方便地連接到pNULPGE200的35S啟動子與NOS終止子之間的多個克隆酶切位點MCS，使目的基因能夠在植物體內穩定表達；同時該質粒載體還具有獨立表達的卡那霉素NPT II耐性基因和sGFP綠色熒光蛋白報告基因，能夠顯著提高轉基因植物細胞的選拔效果；

所述質粒載體pNULPGE200的構建，包括如下步驟：

S1、在pKAFCR1質粒的35S啟動子和NOS終止子之間引入多克隆酶切位點MCS

S11、利用限制性內切酶Xba I和Sac I，對pKAFCR1質粒進行雙酶切處理，切除其原有的Xba I到Sac I部分；

S12、將雙酶切后的pKAFCR1經1％的瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取目的條帶，通過常規的凝膠回收方法或凝膠回收試劑盒獲得已切除Xba I和Sac I部分的pKAFCR1；

S13、人工合成以下兩條單鏈DNA：

CR1MCSin-S：

5’-CTAGAGTTAACTTAATTAACCCGGGAGGCCTGGTACCCTCGAGGAGCT-3’；

CR1 MCS in-A：

5’-CCTCGAGGGTACCAGGCCTCCCGGGTTAATTAAGTTAACT-3’；

然后采用溫度梯度退火法，使兩條單鏈DNA構成一條雙鏈DNA片段，該片段含有Xba I、Hpa I、Pac I、Xma I(Sma I)、Stu I、Kpn I、Xho I和Sac/等多個克隆酶切位點MCS；反應條件為94℃ 3 sec，95℃ 5 min，95℃至25℃溫度梯度0.1℃/sec，25℃ 15 min；

S14、利用T4-DNA連接酶或質粒連接用試劑盒將已切除Xba I和Sac I部分的pKAFCR1與人工合成DNA片段進行連接，連接后的重組質粒利用熱激法轉化到大腸桿菌DH5α菌株的感受態細胞中；

S15、將轉化后的大腸桿菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固體培養基上培養，挑取單獨菌落進行菌落PCR鑒定，篩選含有MCS重組質粒的陽性菌落；

S16、陽性菌落經25mg/L青霉素的LB液體培養基擴繁后，利用常規的質粒提取方法或質粒提取試劑盒提取重組質粒DNA并進行測序驗證，該重組質粒命名為pKAFCR1’；

S2、pNULPGE200質粒的構建

S21、利用限制性內切酶Hind III和Pvu II，對pKAFCR1’進行雙酶切處理，通過凝膠電泳分離、回收獲得包含35S-MCS-NOS片段；

S22、利用限制性內切酶Hind III和Stu I對pKAFCR100進行雙酶切處理，通過凝膠電泳分離、回收獲得雙酶切后的pKAFCR100；

S23、利用T4-DNA連接酶或質粒連接用試劑盒將35S-MCS-NOS片段與酶切后的pKAFCR100進行連接，連接后的重組質粒利用熱激法轉化到大腸桿菌DH5α菌株的感受態細胞中；

S24、將轉化后的大腸桿菌平涂于含有50mg/L卡那霉素的LB培養基培養，挑取單獨菌落進行菌落PCR鑒定，篩選含有35S-MCS-NOS重組質粒的陽性菌落；

S25、將陽性菌落經50mg/L卡那霉素的LB培養基擴繁后，利用常規的質粒提取方法或質粒提取試劑盒提取重組質粒載體DNA，該重組質粒載體命名為pNULPGE200。

2.如權利要求1所構建的用于植物基因表達載體構建的質粒載體的應用，其特征在于，用此質粒載體構建出的植物基因表達載體，以及利用該基因表達載體進行基因轉化培育的轉基因植物細胞或植物體。