[發明專利]禽白血病病毒混合感染中單一病毒的純化方法

在審

• 申請號: 201710350008.4
• 申請日: 2017-05-17
• 公開（公告）號: CN107058246A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 王培坤;林璐璐;楊永立;李海娟;磨美蘭;韋天超;黃騰;韋平
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于病毒純化技術領域，尤其涉及一種禽白血病病毒混合感染中單一病毒的純化方法。

背景技術

禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)是反轉錄病毒科、白血病/肉瘤病毒群。1868年Roloff報道了一例“淋巴肉瘤”，這是第一篇關于禽白血病的報道。隨后，ALV在各地均有相關報道，宿主范圍逐漸擴大，從肉雞傳播到蛋雞以及地方品種雞，臨床腫瘤表現也愈發明顯，給養禽業造成了較大的經濟損失。

ALV分為A、B、C、D、E、J、K共7個亞群，其中A、B、J亞群在臨床易分離到，K亞群為近期發現的新亞群。ALV可引起機體免疫抑制，降低疫苗免疫的成功率，嚴重影響生產性能。近年來，ALV混合感染有增多趨勢，大多存在兩個亞群甚至三個亞群的混合感染。這就需要對禽白血病病毒的流行趨勢和遺傳變化機制進行研究，而獲得單一亞型病毒是研究的基礎與前提。臨床中，雞群會出現不同亞群的ALV混合感染的情況，因此病毒的純化是亟待解決的問題。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種禽白血病病毒混合感染中單一病毒的純化方法，以便于從禽白血病病毒混合感染中獲得單一亞型病毒，為禽白血病病毒分子生物學特征及其致病性的研究提供技術支持。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：禽白血病病毒混合感染中單一病毒的純化方法，通過測定混合感染病毒的TCID₅₀進行終點稀釋，采用稀釋后的病毒液接種DF-1細胞，收集上清與細胞培養物并用分型鑒定引物與IFA的對其進行鑒定，從而獲得單一亞型的禽白血病病毒。

分型鑒定引物包括ALV-A引物對、ALV-B引物對、ALV-J引物對，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的堿基序列。

上述禽白血病病毒混合感染中單一病毒的純化方法，按以下步驟操作進行：

(1)獲得混合感染病毒在DF-1增殖3代，第3代通過接種DF-1細胞，隨后通過檢測ALV-p27抗原并按照Reed-Muench方法測得病毒TCID₅₀；

(2)病毒液以測定TCID₅₀進行終點稀釋，稀釋后病毒液以24孔板復孔作用于單層DF-1細胞2h，隨后換液維持培養至9天；

(3)收集細胞培養物上清并分別編號保存于-80℃，細胞培養物收集抽取DNA并用分型引物鑒定；

(4)鑒定為單一亞型病毒感染的對應孔細胞上清接種DF-1細胞增殖3代進行IFA分型鑒定(，鑒定為單一亞型的病毒進行下一步研究。)

步驟(1)檢測ALV-p27抗原采用IDEXX ALV-p27試劑盒。

步驟(2)稀釋采用的稀釋液為Gibco生產DMEM。

步驟(2)維持培養采用的培養液為含1％FBS的DMEM。

針對目前禽白血病病毒不同亞型混合感染的趨勢增多的情況，發明人建立了一種白血病病毒混合感染中單一病毒的純化方法，通過測定混合感染病毒的TCID₅₀進行終點稀釋，采用稀釋后的病毒液接種DF-1細胞，收集上清與細胞培養物并用分型鑒定引物與IFA的對其進行鑒定，從而獲得單一亞型的禽白血病病毒。該法對實驗條件要求簡單，具有很高的實際應用價值。實驗結果證明，本發明可以成功的對不同亞型混合感染的ALV進行純化，可為禽白血病病毒分子生物學特征及其致病性的研究提供技術支持。

附圖說明

圖1是使用分型引物對純化后細胞培養物PCR鑒定的結果圖，圖中：M是DL2000 DNA Maker；1是ALV-A擴增結果；2是ALV-B擴增結果；3是ALV-J擴增結果；4是陰性對照。

圖2是免疫熒光方法檢測的結果圖，圖中：A是毒株GX14MM6-2M在DF-1細胞中針對A亞型單抗IFA結果；B是毒株GX15MM6-2-Mix在DF-1細胞中針對B亞型單抗IFA結果；C是毒株GX15MM6-2-Mix在DF-1細胞中針對J亞型單抗IFA結果；D是陰性對照結果。

具體實施方式

1.1毒株

混合感染A、B、J亞型的禽白血病病毒來自中國分離株GX15MM6-2-Mix株(申請人實驗室保存)。

1.2方法

1.2.1引物設計

引物參照文獻設計，ALV的分型引物見表1，并由上海華大生物工程有限公司合成。

表1引物序列

1.2.2毒株GX15MM6-2Mix的復蘇