[發明專利]提高DNB雙末端測序質量的方法和DNB雙末端測序方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201710349201.6
• 申請日: 2017-05-17
• 公開（公告）號: CN108070642B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 龔梅花;王靜靜;羅銀鈴;羅宇芬;李長英;陳奧;徐崇鈞;章文蔚
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

本發明公開了一種提高DNB雙末端測序質量的方法和DNB雙末端測序方法和試劑盒。本發明的提高DNB雙末端測序質量的方法，包括：對DNA納米球進行一鏈合成測序時，使用部分dUTP代替dTTP進行聯合探針錨定聚合測序；在所述一鏈合成測序完成后，使用USER酶消化一鏈上的尿嘧啶，然后使用變性劑洗脫一鏈或使用外切酶消化一鏈。本發明的方法能夠實現完全去除一鏈的目的，降低一鏈對二鏈的負面影響，從而提高DNB雙末端測序的讀長和質量。

技術領域

本發明涉及測序技術領域，尤其涉及基于DNA納米球(DNB)的基因測序技術領域，特別涉及一種提高DNB雙末端測序質量的方法和DNB雙末端測序方法和試劑盒。

背景技術

滾環擴增(Rolling Circle Amplification，RCA)是借鑒自然界中環狀病原微生物DNA分子的滾環復制方式而建立的一種恒溫核酸擴增技術，美國Complete GenomicsInc.(簡稱CG)利用RCA技術開發了基于DNA納米球(DNA nanoball,DNB)的基因測序平臺，并將其商業化。2012年華大基因收購CG，開始利用CG專利技術研發新一代雙末端測序技術，基于RCA原理的DNB技術再次取得重要突破，成為領域關注熱點。

與其他二代測序技術相比較，DNB測序技術具有以下幾個優勢：DNB通過增加待測DNA的拷貝數而增強了信號強度，從而提高測序準確度；不同于PCR指數擴增，滾環擴增技術的擴增錯誤不會累積；DNB與芯片上活化位點的大小相同，每個位點只固定一個DNB，保證信號點之間不產生相互干擾；這些優勢也將意味著DNB測序技術在未來測序方向有重要意義。

DNB雙末端測序目前主要是基于多重置換擴增法，如圖1所示，主要流程包括：基因組DNA首先經過片段化處理，再加上接頭序列，并環化形成單鏈環狀DNA，隨后使用滾環擴增技術可將單鏈環狀DNA擴增2-3個數量級，所產生的擴增產物稱為DNA納米球，最終DNA納米球經過DNB裝載技術固定在陣列化的硅芯片上，通過聯合探針錨定聚合技術(cPAS)進行第一鏈(Forward Strand)測序，在具備鏈置換功能的高保真聚合酶的作用下，形成第二鏈(Reverse Strand)，并通過DNA分子錨，進行第二鏈的測序，具有合成快、準確度高等優點。

基于多重置換擴增法的DNB雙末端測序，隨著一鏈測序讀長的增加，一鏈和模板鏈的結合能力大大增強，而且DNB本身結構等復雜因素，單純利用高保真聚合酶很難把一鏈置換完成，無法直接用變性劑洗脫，對二鏈模板的合成有負面影響，從而影響了二鏈的測序讀長和質量。

發明內容

本發明提供一種提高DNB雙末端測序質量的方法和DNB雙末端測序方法和試劑盒，本發明的方法利用USER酶能使尿嘧啶位置產生單核苷酸缺口的特性，在一鏈合成過程中引入部分dUTP，通過USER酶切割使得一鏈片段化，有效減少一鏈和模板鏈的結合能力，然后洗脫和消化一鏈以減小一鏈對二鏈測序質量的影響，有效提高DNB雙末端測序數據質量和讀長。

根據本發明的第一方面，本發明提供一種提高DNB雙末端測序質量的方法，包括：對DNA納米球進行一鏈合成測序時，使用部分dUTP代替dTTP進行聯合探針錨定聚合測序；在上述一鏈合成測序完成后，使用USER酶消化一鏈上的尿嘧啶，然后使用變性劑洗脫一鏈或使用外切酶消化一鏈。

進一步地，上述dUTP占dUTP和dTTP總量的1％～99％，優選50％～75％。

進一步地，上述dUTP占dUTP和dTTP總量的50％。

進一步地，上述變性劑是甲酰胺。