[發明專利]一種篩選中藥神經活性成分的細胞膜固相色譜法及其應用

有效

• 申請號: 201710347152.2
• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN106990200B
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 聶紅;潘儉豪;徐曉云;湯丹;張喆
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

本發明公開一種篩選中藥神經活性成分的細胞膜固相色譜法及其應用，該方法包括如下步驟：通過液質聯用建立待篩選中藥苦參提取液指紋圖譜；分離與培養背根神經節細胞；利用背根神經節細胞膜固相化結合篩選苦參提取液中的效應成分；洗脫未結合成分；解離并通過液質聯用檢測活性成分解離液成分。本發明用小鼠DRG細胞固相色譜技術作為抗瘙癢藥物初篩的細胞模型，為篩選具有“止癢”作用的中藥活性成分提供了新方法，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于中藥活性成分篩選及作用機制研究領域，特別涉及一種篩選中藥神經活性成分的細胞膜固相色譜法及其應用。

背景技術

傳統細胞膜色譜(Cell Membrane Chromatography，CMC)首先需要制備細胞膜，再采用硅膠吸附的方法制備固定相，通常將固定相濕法裝柱后以磷酸緩沖液為流動相，分析比較中藥成分在色譜柱上的保留特性。細胞膜色譜力求盡量保持受體的“原位”性，模擬受體生存環境，使得藥物分子與受體的相互作用更接近真實狀態，研究細胞膜上的受體與配體的結合特性。細胞膜色譜同時也存在明顯的不足，例如細胞受體的結合位點在細胞膜內外都存在，有分類方法將受體種類分為離子通道型、G-蛋白偶聯型、酪氨酸激酶型以及細胞核內受體等，實際上還有細胞漿、細胞器內的各種酶等。細胞膜色譜研究中由于活細胞的破壞使得細胞內受體不復存在，因而失去了驗證作用于這部分靶點的效應成分的機會。還有部分受體是由于另一些受體被激活后，通過活細胞的各種信號傳導通路而被激活，這部分受體由于偶聯作用需要活細胞的功能，其配體也不容易為細胞膜色譜所發現。此外該方法對流動相緩沖溶液的組成、pH值、柱溫、柱壓、流速等要求苛刻，難以最大限度保持細胞受體活性。通過細胞膜固相色譜(Cell Membrane Immobilized Chromatography，CMIC)技術，將細胞與藥液孵育使藥液中活性成分與細胞膜表面受體結合，沖洗未吸附成分，再解離并檢測吸附成分。省去了將細胞固定在硅膠這一步，既節約經費和時間，又有利于保持生物靶點的活性，是對CMC技術的一大創新和改進。目前已有研究人員利用多種生物材料如原代巨噬細胞，脾細胞，肺組織細胞成功用于三七、脈絡寧等中藥活性成分的辨識，顯示出良好的應用前景。

癢覺，尤其是慢性瘙癢的具體傳導分子機制目前還不完全明確，且經常在多種疾病中作為并發癥出現，據統計，美國特應性皮炎患者每年的醫療花費也已超過3億美元。但目前慢性瘙癢的治療不容樂觀，由于各種慢性瘙癢的病理機制不同，現在市場上并沒有可以有效治療各種慢性瘙癢疾病的特效藥或醫療措施。對于占比超過80％的慢性頑固性瘙癢，目前常見的止癢藥往往療效欠佳或有較嚴重副作用，例如臨床上治療瘙癢常用的抗過敏藥、抗組胺藥、糖皮質激素可能導致的精神萎靡、免疫紊亂等癥狀。因此闡明癢覺的產生與傳導機制、篩選有抗瘙癢活性的物質對瘙癢的防治、抗瘙癢藥物的開發極其重要。

實驗研究中可將癢覺分為組胺依賴型瘙癢(由致癢劑直接或者間接引起組胺釋放而引起的瘙癢)與組胺非依賴型瘙癢(由不會引起組胺釋放的致癢劑引起的瘙癢)，組胺依賴型瘙癢多為急性瘙癢例如蕁麻疹、過敏引起的風團濕疹等可以通過服用組胺拮抗劑治療；而組胺非依賴型瘙癢則多數為慢性頑固性的瘙癢，組胺拮抗劑通常療效欠佳，例如特應性皮炎、接觸性皮炎、銀屑病等瘙癢。由于目前對組胺非依賴型瘙癢并無有效的療法或藥物，因此對組胺非依賴型瘙癢的機制研究是神經生物學領域一個極具挑戰性的研究課題，而對其藥物的開發也是目前皮膚病藥物研究的一大熱點。

由于瘙癢是一種復雜的神經生理行為，因此抗瘙癢藥物多數都是直接運用動物行為學來篩選，耗費大量時間與金錢，如何更為高效篩選抗瘙癢藥物成為目前亟待解決的問題。隨著神經科學的發展，對癢覺的研究逐漸深入，并發現了初級傳入神經元上大量癢覺相關受體和免疫與癢覺的聯系。本發明以此為基礎用細胞篩選傳統抗瘙癢中藥苦參中的活性成分，并驗證其活性成分的抗瘙癢效果。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種篩選中藥神經活性成分的細胞膜固相色譜法。

本發明的又一目的在于提供的所述細胞膜固相色譜法在中藥神經活性成分篩選中的應用。