[發(fā)明專利]一種為肺癌提供離體個體化藥物測試的方法及培養(yǎng)基

在審

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• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN107151645A
• 公開（公告）日: 2017-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李暉;陳雨;葉立娜;吳小婷;趙天龍;張康;蔡鎧紅;魏高斌;曾志宏
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)深圳研究院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/09;C12Q1/02
• 代理公司: 武漢科皓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)42222
• 代理人: 彭勁松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細胞生物學(xué)與藥理學(xué)領(lǐng)域，涉及一種為肺癌提供離體個體化藥物測試系統(tǒng)的建立及培養(yǎng)基。

背景技術(shù)

肺癌是中國和世界范圍內(nèi)最常見也是死亡率最高的惡性腫瘤，是危害人類健康的頭號殺手。肺癌按病理分型可分為非小細胞肺癌（NSCLC）和小細胞肺癌（SCLC），約占所有肺癌的80%和20%。非小細胞肺癌中，鱗癌約占20%-35%，腺癌約占30%-45%。肺癌確診時多數(shù)患者分期較晚是影響肺癌預(yù)后的重要原因，而早期肺癌可以通過多學(xué)科綜合治療實現(xiàn)較好的預(yù)后，可以得到更好的臨床獲益。NSCLC的腫瘤細胞生長速度及惡性程度均比SCLC低，但對放化療不如SCLC敏感。化療是晚期NSCLC綜合治療的重要手段，在肺癌的治療中占有非常重要的地位，但有效率只有20-40％。腫瘤的多藥耐藥現(xiàn)象和臨床上缺乏個體化治療是導(dǎo)致化療失敗的重要原因。準確的化療藥物體外敏感性檢測是制定個體化治療方案的前提。因此如何針對性的選擇化療藥物，避免無效治療，降低患者痛苦，提高臨床上的療效日益受到越來越多科研人員和醫(yī)學(xué)工作者的關(guān)注與重視。

有文獻報道體外藥敏的檢測結(jié)果與臨床治療療效的總體符合率約為80%，具有較高的敏感度和特異度，表明體外藥敏試驗與臨床治療敏感性有較好的相關(guān)性，且具有操作簡易和經(jīng)濟可行等優(yōu)勢。然而體外藥敏評價細胞模型也存在建立成功率低、腫瘤間質(zhì)細胞混雜、無法長期培養(yǎng)等問題。一直以來受限于原代腫瘤細胞體外培養(yǎng)的技術(shù)，很難建立來源于肺癌患者的原發(fā)腫瘤細胞模型，因為這樣的模型不僅需要能夠在體外穩(wěn)定培養(yǎng)，而且能反映出患者體內(nèi)腫瘤細胞的特性，代表真正原發(fā)位點的腫瘤生物學(xué)特性，才能作為理想的體外藥敏檢測模型。從腫瘤的個體化治療角度而言，只有在體外分離培養(yǎng)原代腫瘤細胞穩(wěn)定傳代后，才能進行更多更廣泛的臨床前藥敏檢測，結(jié)合臨床經(jīng)驗設(shè)計藥物劑量和藥物組合，才能確定最優(yōu)化的化療使用方案安排臨床治療。

此外，抗腫瘤藥尤其是化療藥引起的肺毒性反應(yīng)嚴重影響患者的生存質(zhì)量，甚至危及生命的化療限制性毒性。抗腫瘤藥相關(guān)肺損傷可涉及氣道、胸膜、縱膈、肺血管，最常見的肺毒性是間質(zhì)性肺疾病（ILD）。可致肺毒性的代表腫瘤藥以博來霉素、甲氨蝶呤、絲裂霉素、馬利蘭、洛莫司汀為首。其他可能導(dǎo)致ILD的腫瘤藥：阿糖胞苷、紫杉醇類、環(huán)磷酰胺、吉西他濱、伊立替康、奧沙利鉑、長春堿、拓撲替康、多柔比星、依托泊苷，靶向藥物如貝伐單抗、利妥昔單抗、曲妥珠單抗、厄洛替尼、吉非替尼。因此，增加對肺正常組織細胞的毒性評價顯得尤為重要，也是未來的肺癌藥敏試驗個體化治療需要優(yōu)化之處。

綜上所述，患者來源的癌細胞和癌旁正常細胞的培養(yǎng)一直以來是世界性的技術(shù)難題。如果能建立個體的肺原代上皮細胞和肺原代腫瘤細胞的體外長期培養(yǎng)體系，并利用該體系進行藥敏檢測，體外預(yù)測患者對常用化療藥物的敏感性和評價藥物的安全性，將為肺癌精準化療敏感藥物的選擇提供參考，盡可能地減輕毒性和副作用負擔(dān)，最大限度地延長該肺癌患者的生存時間。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種用于人或哺乳動物原代正常上皮細胞和原代腫瘤細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基及基于該培養(yǎng)基為肺癌提供穩(wěn)定準確可靠的離體個體化藥物測試的方法。

本發(fā)明的第一方面，提供一種用于培養(yǎng)人或哺乳動物的原代正常上皮細胞和原代腫瘤細胞的培養(yǎng)基M，所述培養(yǎng)基M成分包括：DMEM與Ham’s F-12 NUTRIENT MIX按體積比3:1混合的培養(yǎng)基，同時添加4-6％胎牛血清、1-3nM 三碘甲狀腺氨酸（triiodothyronine）, 0.4-0.65％胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒鈉（insulin-transferrin-selenium）、5-20 uM Y-27632、9-11ng/mL表皮生長因子、0.3-0.5μg/mL氫化可的松、0.5-1.5nM霍亂毒素、0.4-0.6μg/mL兩性霉素B、35-45μg/mL慶大霉素，激活素A（Activin A） 5-20 ng/ml及3ug/ml重組人R-Spondin-1。

本發(fā)明的第二方面，提供一種短期內(nèi)快速增殖的肺癌病人肺上皮細胞和腫瘤細胞的原代分離培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的方法，包括如下具體步驟：

A、肺癌和癌旁組織樣本的取材及其樣本儲存運輸

A1、樣本標準：肺癌患者手術(shù)樣本（適宜手術(shù)患者，切除的癌組織及癌旁組織樣品至少1×1×1cm³）或活檢、穿刺小樣本（不適宜手術(shù)患者，纖支鏡或CT引導(dǎo)經(jīng)皮穿刺可獲得的小樣本），涵蓋各臨床分期；