[發明專利]一種為肺癌提供離體個體化藥物測試的方法及培養基

在審

• 申請號: 201710345315.3
• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN107151645A
• 公開（公告）日: 2017-09-12
• 發明（設計）人: 李暉;陳雨;葉立娜;吳小婷;趙天龍;張康;蔡鎧紅;魏高斌;曾志宏
• 申請（專利權）人: 武漢大學深圳研究院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/09;C12Q1/02
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙)42222
• 代理人: 彭勁松

1.一種用于培養人或哺乳動物的原代正常上皮細胞和原代腫瘤細胞的培養基M，其特征在于，所述培養基M成分包括：DMEM與Ham’s F-12 NUTRIENT MIX按體積比3:1混合的培養基，同時添加4-6％胎牛血清、1-3nM 三碘甲狀腺氨酸, 0.4-0.65％胰島素-轉鐵蛋白-硒鈉、5-20μM Y-27632、9-11ng/mL表皮生長因子、0.3-0.5μg/mL氫化可的松、0.5-1.5nM霍亂毒素、0.4-0.6μg/mL兩性霉素B、35-45μg/mL慶大霉素，激活素A 5-20 ng/ml及3μg/ml重組人R-Spondin-1。

2.一種肺癌病人肺上皮細胞和肺腫瘤細胞的原代分離培養和傳代培養的方法，其特征在于，包括如下具體步驟：

A、肺癌和癌旁組織樣本的取材及其樣本儲存運輸：

A1、樣本標準：肺癌患者手術樣本至少1×1×1cm³或活檢、穿刺小樣本，涵蓋各臨床分期；

A2、樣本儲存運輸：潔凈室條件下，嚴格按照無菌操作標準，將手術樣本或小樣本收集保存于試管中，根據樣本量大小添加樣本收集液，一般為3-5mL，樣本收集液為含2%青/鏈霉素和100ug/ml制霉菌素的PBS，樣本可用于直接分離培養或長期液氮保存；樣本直接分離培養時可先放置于4℃冰箱，但保存不宜超過48小時；樣本儲存于液氮前，需加入覆蓋樣本體積的冰浴后的PBS緩沖液清洗兩次，每次10秒左右，用無菌鑷子將清洗干凈的樣本放入新培養皿中，用眼科剪剪碎至米粒大小，加入1mL樣本凍存液，移液器轉移保存于細胞凍存管，放入程序降溫盒中，-80℃冰箱過夜冷藏，次日可轉移至液氮中長期儲存；所述樣本凍存液為胎牛血清（10099-141，Gibco）與二甲基亞砜（DMSO，(CH3)2SO）溶液按體積比為9:1配制；需要運輸的樣本在經過-80℃冰箱過夜冷藏后可放入體積合適的泡沫盒，加入足量的運輸干冰，密封冰凍運輸；

B、對來自于肺癌和癌旁組織樣本的肺上皮細胞和腫瘤細胞的原代分離培養：

B1、分離培養前的實驗室準備：使超凈工作臺處于開機狀態，并打開紫外燈，工作30-60分鐘后，關閉紫外燈，打開調風機調節風量大小，保證工作區內的風速始終處于理想狀態后開始實驗；準備五個60mm或100mm細胞培養皿（伽馬射線消毒滅菌，無熱源、無RNA酶、無DNA酶），標記為①②③④⑤，按照順序擺放，在②號培養皿加入10mL無水乙醇（分析純），③、④號培養皿分別加入冰浴的10mLPBS緩沖液；

B2、配制消化液：所述消化液為含0.2mg/mL膠原酶/透明質酸酶混合液的培養基M；

B3、樣本直接分離培養：

B3.1、移去樣本收集液將樣本放置①號培養皿，依次在②號培養皿無水乙醇和③、④號培養皿PBS緩沖液清洗，然后分別將肺癌和癌旁組織樣本放入⑤號無菌培養皿中，用無菌的眼科剪將組織盡可能剪碎，大小1-2mm³體積為宜，剪碎過程中滴加適量PBS緩沖液維持樣本組織活性；

B3.2、在⑤號無菌培養皿中加入含步驟B2所配制消化液，分別消化剪碎后的肺癌和癌旁組織樣本；

B3.3、分別將步驟B3.2處理后的肺癌和癌旁組織樣本低速離心去除上清，速度為1000prm，時長為8分鐘；

B3.4、分別將步驟B3.3處理后的肺癌和癌旁組織樣本沉淀室溫條件下重懸于2-5ml，濃度為0.25％胰酶/EDTA中消化；

B3.5、加入于胰酶/EDTA 2倍體積的含10%FBS的DMEM培養基終止消化，分別用無菌的一次性塑料槍頭反復吹打肺癌和癌旁組織樣本，時長為1分鐘；

B3.6、分別用70 μm細胞篩過濾細胞懸液，收集過濾后的細胞懸液，1000prm低速離心，時長為10分鐘去除上清；

B3.7、分別重懸步驟B3.6中的正常細胞沉淀和腫瘤細胞沉淀于PBS緩沖液中清洗，收集清洗后的細胞懸液，1000prm低速離心，時長為5分鐘去除上清；

B3.8、分別重懸步驟B3.7中的正常細胞沉淀和腫瘤細胞沉淀于培養基M中，接種于培養瓶培養,靜置培養36-48小時后顯微鏡觀察拍照記錄細胞克隆生長情況；

或者，

B3’、 當樣本為運輸樣本和液氮儲存樣本時的分離培養

B3’.1、復蘇時需要在40℃醫用恒溫水箱中快速溶解，經75%醫用消毒酒精擦拭后生物傳遞窗傳送至細胞培養室；

B3’.2、取15mL離心管加入適量PBS緩沖溶液，移液器移取溶解后的含樣本的凍存液至離心管中，1000rpm低速離心5分鐘，小心移去含凍存液的上清，并嚴格執行收到新鮮組織樣本的所有實驗操作B3.1-B3.8；

C、建立大量擴增肺癌病人肺原代上皮細胞和肺原代腫瘤細胞的傳代培養：

C1、試劑配制：配備DMEM培養基、HBSS緩沖溶液、0.25%胰蛋白酶/EDTA等，用HBSS緩沖溶液與0.25%胰蛋白酶/EDTA配制成0.05%胰蛋白酶/EDTA，PBS緩沖溶液與胎牛血清以9:1的體積比配制成10%的消化終止液；

C2、當細胞培養瓶中培養的人肺原代上皮細胞和肺原代腫瘤細胞增殖至70-90%豐度時，用1X PBS緩沖液洗滌細胞兩次，再用0.05%胰酶/EDTA消化單層細胞2-5分鐘；

C3、含10%FBS的DMEM培養基中和消化反應，1000prm低速離心3-4分鐘去除上清；

C4、以1:2，1:3，1:4或1:5比例分別重懸正常細胞沉淀和腫瘤細胞沉淀于培養基M中接種培養，比例的選擇只要維持細胞貼壁和正常生長即可。