[發明專利]具有ACE抑制功能的牦牛骨蛋白肽及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710345158.6
• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN107082807B
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發明（設計）人: 張恒;羅永康
• 申請（專利權）人: 安徽國肽生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12P21/06;A23L33/18;A61K38/39;A61P9/12
• 代理公司: 北京金言誠信知識產權代理有限公司 11229
• 代理人: 劉寶榮

1.一種具有ACE抑制功能的牦牛骨蛋白肽，其特征在于，所述牦牛骨蛋白肽的采用以下方法制備：

1) 以牦牛骨為原料，經高溫蒸煮和去脂得到牦牛骨蛋白液，將制得的牦牛骨蛋白液在75-85℃下，經頻率為80-100kH的超聲波超聲處理15-25分鐘以改變牦牛骨蛋白的組織結構；

2)將步驟1)制得的牦牛骨蛋白液經過復合蛋白酶分步酶解且不添加酸和堿，所述復合蛋白酶分步酶解包括以下步驟：第一步酶解反應：向蛋白重量8-10wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％第一復合蛋白酶，在50～60℃條件下進行酶解反應0.5～1.5h，其中，第一復合蛋白酶為堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶；第二步酶解反應：向第一步酶解反應產物中加入0.2～0.5wt％第二復合蛋白酶，在45～55℃條件下進行酶解反應1.0～2.0h，其中，第二復合蛋白酶為胰蛋白酶和風味蛋白酶；

3)將步驟2)酶解后的產物除雜、膜分離、凝膠分離以及反相HPLC分離，濃縮，冷凍干燥后即得；

其中，所述牦牛骨蛋白肽的整個加工過程中沒有添加酸或堿進行pH的調整；所述步驟3)中除雜具體為：

在90～95℃下保溫10～20分鐘，冷卻至室溫，加入酶解液重量0.2-0.6wt％的活性炭于酶解液中，通過硅藻土進行分離，收集分離液；

所述步驟3)中膜分離具體為：將除雜后的產物通過兩步超濾方法進行處理，先后利用孔徑為5000道爾頓的膜和孔徑為3000道爾頓的膜進行超濾；

所述步驟3)中凝膠分離和反相HPLC具體為：

將膜分離后的產物經過Sephadex G-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到牦牛骨蛋白肽粗品；再用RP-HPLC反相高效液相色譜進行1次分離，收集經過RP-HPLC反相高效液相色譜分離中16-18分鐘的肽洗脫液；

其中所述的牦牛骨蛋白肽包括具有如下氨基酸序列的含量在50％以上多肽：

Glu-Ile-Arg-Met-Leu，

Thr-Val-Ser-Leu-Pro-Arg，

和Ser-Pro-Ile-Leu-Gly-Tyr-Trp。

2.制備權利要求1所述的牦牛骨蛋白肽的方法，包括以下步驟：

1)以牦牛骨為原料，經高溫蒸煮和去脂得到牦牛骨蛋白液，將制得的牦牛骨蛋白液在75-85℃下，經頻率為80-100kH的超聲波超聲處理15-25分鐘以改變牦牛骨蛋白的組織結構；

2)將步驟1)制得的牦牛骨蛋白液經過復合蛋白酶分步酶解且不添加酸和堿，所述復合蛋白酶分步酶解包括以下步驟：第一步酶解反應：向蛋白重量8-10wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％第一復合蛋白酶，在50～60℃條件下進行酶解反應0.5～1.5h，其中，第一復合蛋白酶為堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶；第二步酶解反應：向第一步酶解反應產物中加入0.2～0.5wt％第二復合蛋白酶，在45～55℃條件下進行酶解反應1.0～2.0h，其中，第二復合蛋白酶為胰蛋白酶和風味蛋白酶；

3)將步驟2)酶解后的產物除雜、膜分離、凝膠分離以及反相HPLC分離，濃縮，冷凍干燥后即得；

其中，所述牦牛骨蛋白肽的整個加工過程中沒有添加酸或堿進行pH的調整；所述步驟3)中除雜具體為：

在90～95℃下保溫10～20分鐘，冷卻至室溫，加入酶解液重量0.2-0.6wt％的活性炭于酶解液中，通過硅藻土進行分離，收集分離液；

所述步驟3)中膜分離具體為：將除雜后的產物通過兩步超濾方法進行處理，先后利用孔徑為5000道爾頓的膜和孔徑為3000道爾頓的膜進行超濾；

所述步驟3)中凝膠分離和反相HPLC具體為：

將膜分離后的產物經過Sephadex G-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到牦牛骨蛋白肽粗品；再用RP-HPLC反相高效液相色譜進行1次分離，收集經過RP-HPLC反相高效液相色譜分離中16-18分鐘的肽洗脫液。

3.權利要求1所述的牦牛骨蛋白肽在制備預防或治療受益于ACE抑制的疾病的藥物或食品中的應用。