[發明專利]豬GM?CSF蛋白的制備方法及其注射液和應用

在審

• 申請號: 201710343196.8
• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN107188951A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 錢泓;吳有強;張強;徐玉蘭;聞雪;姜冰潔;白志軍;查銀河;江海
• 申請（專利權）人: 浙江海隆生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/535
• 分類號: C07K14/535;C12N15/70;A61K38/19;A61K39/39;A61P37/04
• 代理公司: 北京乾誠五洲知識產權代理有限責任公司11042
• 代理人: 付曉青,李廣文

技術領域

本發明涉及一種豬GM-CSF蛋白的制備方法和應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

細胞因子(cytokine，CK)是免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導多種細胞產生的低分子量可溶性蛋白質或多肽，通過與細胞表面的受體相互作用，從而具有調節固有免疫、適應性免疫、血細胞生成、細胞生長以及損傷組織修復等多種生物學功能。細胞因子分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等。細胞因子在體內通過旁分泌、自分泌或內分泌等方式發揮作用，具有多效性、重疊性、拮抗性、協同性等多種生理特性。細胞因子不僅具有廣泛的對疾病的治療作用，還具有明顯的免疫佐劑效應，可增強病毒疫苗、細菌疫苗和寄生蟲疫苗的保護效應，特別是亞單位疫苗在增強刺激細胞免疫方面的作用。

在進行造血細胞的體外研究中，發現一些細胞因子可刺激不同的造血干細胞在半固體培養基中形成細胞集落，這類因子被命名為集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)。根據集落刺激因子的作用范圍，分別命名為粒細胞CSF(G-CSF)，巨噬細胞CSF(M-CSF)，粒細胞和巨噬細胞CSF(GM-CSF)，多能集落刺激因子(multi-CSF,又稱IL-3)，干細胞因子(SCF)和紅細胞生成素(EPO)。它們對不同發育階段的造血干細胞起促增殖、分化的作用，是血細胞發生必不可少的刺激因子。

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是由T細胞、B細胞、巨噬細胞、內皮細胞等在某些抗原和細胞因子作用下刺激產生的具有多種生物學活性的一類集落刺激因子。GM-CSF不僅能刺激造血細胞增殖、分化和成熟，并從骨髓向外周血轉移，還能活化中性粒細胞、巨噬細胞及其他單核細胞。因此，GM-CSF在疾病治療中有非常廣泛的作用，目前在人醫中已經廣泛使用，但在豬用的藥品中，還沒有GM-CSF的產品，這是因為目前將人用的GM-CSF制備工藝放在豬用GM-CSF上面，整體復雜，成本高，不利于在獸用產品中推廣和應用。另外，GM-CSF能通過促進包括樹突狀細胞在內的抗原遞呈細胞的增殖分化，將其吸引到注射部位，增強抗原遞呈能力，從而達到增強免疫效果的作用。因此GM-CSF還可以作為免疫佐劑或免疫增強劑，特別是在亞單位疫苗(因為亞單位疫苗在刺激細胞免疫方面的能力較弱)中，具有很廣闊的發展前景。

目前在豬GM-CSF的制備方面還沒有報道，本實驗室嘗試了在真核表達系統中(包括昆蟲桿狀病毒、CHO細胞)和原核表達系統中單獨表達GM-CSF，發現這2個真核系統中表達的GM-CSF產量很低，且蛋白很雜，考慮原因一是因為GM-CSF蛋白小，約17kDa，易降解，二是糖基化比較雜亂，導致分子量差異很大。而原核表達系統單獨表達GM-CSF也存在產量低或檢測無表達，究其原因一是因為GM-CSF蛋白小，可能容易降解，二是因為GM-CSF蛋白在大腸桿菌中表達時折疊錯誤，或形成包涵體，導致檢測時沒有發現表達。

在蛋白類藥物中，單獨直接使用未經修飾的蛋白作為藥物，在藥代學上來看，藥物的半衰期都很短，一般就幾個小時。因此，為了延長藥物的半衰期，一般都選擇對目的蛋白進行修飾。但是，修飾都會極大的增加成本，不利于藥物的推廣，特別是在豬用藥物中的推廣。因此，研發一種可以適當延長半衰期且成本低的注射液是非常必要的，特別是在該藥物的推廣使用過程中。

發明內容

本發明要解決的技術問題一是提供一種成本低、易于推廣應用的豬GM-CSF蛋白的制備方法；二是克服常規技術中單獨表達豬GM-CSF蛋白時由于分子量小而造成的產量低和易降解的問題；三是提供了一種可延長半衰期且成本低的注射液及其制備方法。

根據本發明的一個方面，本發明提供了一種豬粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的制備方法，所述方法包括以下步驟：1)將密碼子優化后的豬GM-CSF基因序列克隆到原核表達質粒中，得到重組質粒；所述原核表達質粒為可低溫誘導表達目的蛋白且含有伴侶蛋白基因序列的質粒，所述克隆時在伴侶蛋白基因序列后面添加一種蛋白酶的酶切位點的基因序列；2)將步驟1)中所述重組質粒轉化大腸桿菌，得到陽性克隆；3)將步驟2)中所述陽性克隆進行發酵，誘導表達含有伴侶蛋白及相應酶切位點的豬GM-CSF重組融合蛋白，得到含有伴侶蛋白及相應酶切位點的豬GM-CSF重組融合蛋白；4)純化步驟3)中豬GM-CSF重組融合蛋白；5)使用能夠切開所述豬GM-CSF重組融合蛋白中酶切位點的蛋白酶對純化后的所述豬GM-CSF重組融合蛋白進行酶切，得到酶切液；以及6)從步驟5)中的酶切液中純化得到豬GM-CSF蛋白。