[發明專利]豬GM?CSF蛋白的制備方法及其注射液和應用

在審

• 申請號: 201710343196.8
• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN107188951A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 錢泓;吳有強;張強;徐玉蘭;聞雪;姜冰潔;白志軍;查銀河;江海
• 申請（專利權）人: 浙江海隆生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/535
• 分類號: C07K14/535;C12N15/70;A61K38/19;A61K39/39;A61P37/04
• 代理公司: 北京乾誠五洲知識產權代理有限責任公司11042
• 代理人: 付曉青,李廣文

1.一種制備豬GM-CSF蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

1)將密碼子優化后的豬GM-CSF基因序列克隆到原核表達質粒中，得到重組質粒；所述原核表達質粒為可低溫誘導表達目的蛋白且含有伴侶蛋白基因序列的質粒，所述克隆時在伴侶蛋白基因序列后面添加一種蛋白酶的酶切位點的基因序列；

2)將步驟1)中所述重組質粒轉化大腸桿菌，得到陽性克隆；

3)將步驟2)中所述陽性克隆進行發酵，誘導表達含有伴侶蛋白及相應酶切位點的豬GM-CSF重組融合蛋白，得到含有伴侶蛋白及相應酶切位點的豬GM-CSF重組融合蛋白；

4)純化步驟3)中豬GM-CSF重組融合蛋白；

5)使用能夠切開所述豬GM-CSF重組融合蛋白中酶切位點的蛋白酶對純化后的所述豬GM-CSF重組融合蛋白進行酶切，得到酶切液；以及

6)從步驟5)中的酶切液中純化得到豬GM-CSF蛋白。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述密碼子優化后的豬GM-CSF基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述可低溫誘導表達目的蛋白且含有伴侶蛋白基因的質粒為pCold-TF質粒，所述伴侶蛋白為TF蛋白。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述克隆時在伴侶蛋白基因序列后面添加的一種蛋白酶的酶切位點的基因序列為TEV蛋白酶的酶切位點基因序列、HRV3C蛋白酶的酶切位點基因序列、Thrombin蛋白酶的酶切位點基因序列，所述TEV蛋白酶的酶切位點的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述大腸桿菌為E.coli BL21(DE3)。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述陽性克隆進行發酵時的培養基配制如下：

6-1)發酵培養基組分1：YE：10g/L；胰蛋白胨：20g/L；KH₂PO₄：1.14g/L；K₂HPO₄：0.9g/L；(NH₄)₂SO₄：3.0g/L；MgSO₄·7H₂O：0.3g/L，調節PH至6.8，定容至2.4L，與發酵罐體一起滅菌121℃，20min；

6-2)發酵培養基組分2：甘油：終濃度30g/L，定容至0.45L，單獨滅菌121℃，20min；

6-3)發酵培養基組分3：VB1：6mg/mL，0.22μm濾膜過濾除菌；

6-4)補料培養基組分1：YE：7.5g；胰蛋白胨：15g，定容至300mL，滅菌121℃，20min；以及

6-5)補料培養基組分2：甘油：45g，定容至150mL，滅菌121℃，20min。