[發明專利]一種抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞疫苗制備方法

在審

• 申請號: 201710341845.0
• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN107137702A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發明（設計）人: 宋靜
• 申請（專利權）人: 北京眾興華納生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61P35/00;C12N15/85;C12N5/0784
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1.一種抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于，其包括如下步驟：構建成微小RNA145-5p的基因片段，重組到載體質粒上后通過脂質體轉染人未成熟樹突狀細胞，其負載腫瘤細胞裂解抗原，制備成樹突狀細胞疫苗；

所述微小RNA145-5p在樹突狀細胞中過表達從而抑制免疫負調控作用的信號調控蛋白α的表達，增強了樹突狀細胞的適應性免疫活性；

所述微小RNA145-5p的基因片段為成熟體微小RNA145，上下游各延長200個堿基，并在5’端和3’端加入限制性酶切位點，構建成微小RNA145-5p重組片段；

其中，重組mir145-5p/pcDNA4基因構建的制備包括步驟如下：

將合成熟體微小RNA145-5p基因序列24個堿基，及其上下游各200個堿基與5’端Kpn I和3’端EcoR I的識別序列構成的基因序列通過化學合成獲得，即mir145-5p；

將mir145-5p的目的DNA片段和pcDNA4載體Kpn I和EcoR I雙酶切后，在T4 DNA連接酶作用下，將兩者于4℃、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆的PCR鑒定和測序鑒定，即mir145-5p/pcDNA4；PCR產物凝膠電泳檢測和測序鑒定符合mir145-p5大小和序列后，將測序正確的菌液轉接于10ml含氨芐的LB液體培養基中，37℃培養過夜，用無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的重組質粒通過核酸定量儀確定DNA濃度，用去離子水稀釋到4ug/μl，然后將重組載體DNA放置-80℃超低溫冰箱中長期保存。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述人未成熟樹突狀細胞，來源于人外周血、骨髓或臍帶血中單核細胞，經小鼠抗人抗CD14免疫磁珠分選獲得CD14陽性單核細胞，在重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、和重組人干細胞生長因子和重組人白介素4誘導培養得到的未成熟樹突狀細胞。

3.根據權利要求1至2中任一項所述的方法，其特征在于，

與未抑制DCs中負調控SIRPα表達的成熟DCs疫苗相比，所述方法制備的DCs疫苗經熒光定量DNA聚合酶鏈式反應技術檢測，其SIRPα基因表達顯著下調40倍以上；經酶聯免疫吸附測定試劑盒檢測，其分泌的白介素12/p70提高20倍以上。

4.根據權利要求1至2中任一項所述的方法，其特征在于，

所述方法制備的樹突狀細胞疫苗，與未抑制DCs中負調控SIRPα表達的成熟DCs疫苗相比，其激活T淋巴細胞增殖倍數為10倍以上，分泌的干擾素γ提高10倍以上；在殺傷腫瘤細胞毒性實驗中效靶比40∶1時殺傷腫瘤細胞達到80％以上。