[發明專利]一種抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞疫苗制備方法

在審

• 申請號: 201710341845.0
• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN107137702A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發明（設計）人: 宋靜
• 申請（專利權）人: 北京眾興華納生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61P35/00;C12N15/85;C12N5/0784
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其中包括如下特征：將構建成微小RNA145-5p(microRNA145-5p，miR-145-5p)的基因片段重組到載體質粒上，通過脂質體轉染人未成熟樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)，并負載腫瘤細胞裂解抗原后，制備成樹突狀細胞疫苗；miR145-5p在樹突狀細胞中過表達可以抑制免疫負調控作用的信號調控蛋白α的表達，增強樹突狀細胞適應性免疫活性。

背景技術

樹突狀細胞是機體內最大抗原遞呈細胞，可激活機體淋巴細胞產生抗腫瘤和抗病毒的適應性免疫反應，是目前在國內外臨床治療癌癥和病毒的常見免疫細胞技術。目前樹突狀細胞常用的培養技術為通過粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、白介素4(interleukin 4，IL-4)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)等其他因子誘導，并負載各類腫瘤抗原后得到樹突狀細胞疫苗，用于抗腫瘤臨床治療。

不過樹突狀細胞不僅具有激活抗腫瘤抗病毒的免疫反應，而且也可以表達免疫負調控因子，對DCs的免疫功能產生抑制作用。其中DCs表達信號調節蛋白α(signal regulatory proteinα，SIRPα)，其可以通過與特異性配體CD47相互作用發揮負向調節作用，我們能觀察到DC表型和功能的抑制，包括DC成熟標志減少，細胞因子IL-12分泌減少。因而抑制DCs表達SIRPα，將能逆轉SIRPα對DCs免疫負調控的作用。

本發明提供了以調控SIRPα基因表達的miR-145-5p基因片段，重組到載體質粒上，通過脂質體轉染人未成熟DCs，并負載腫瘤細胞裂解抗原后，制備成樹突狀細胞疫苗。miR145-5p在樹突狀細胞中過表達將抑制免疫負調控作用的信號調控蛋白α的表達，將增強了其表達共刺激分子、分泌細胞因子能力和激活毒性T淋巴細胞活性的能力，在體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性，更加有助于提高臨床療效和延長患者生存期。

發明內容

本發明針對現有技術培養的樹突狀細胞，并沒有抑制DCs中負調控因子的表達，這樣在臨床治療中共刺激分子表達較低，分泌細胞因子下降以及激活T林細胞因子特異性低與殺傷效果力度有限。我們前期研究中篩選得到DCs中負調控因子SIRPα基因的調控微小RNA，即miR145-5p，其可以調控DCs中負調控因子SIRPα基因的表達，miR145-5p高表達能有效抑制SIRPα基因的表達，從而增強了其對腫瘤細胞殺傷活性與臨床治療療效。

信號調節蛋白a是SIRP家族中最主要的成員，并在髓系細胞包括樹突狀細胞中表達，SIRPα通過與特異性配體CD47相互作用發揮負向調節作用。DCs表面的SIRPα與T淋巴細胞表面的CD47相互結合，雙向負調節DC和T細胞功能，即抑制DCs活化，下調其抗原遞呈能力；并抑制T細胞增殖和殺傷功能，因而抑制DCs表達SIRPα，將有助于產生對腫瘤細胞最佳的免疫活性。

本發明涉及一種抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其中包括如下特征：構建成微小RNA145-5p的基因片段，重組到載體質粒上后通過脂質體轉染人未成熟樹突狀細胞，其負載腫瘤細胞裂解抗原后，制備成樹突狀細胞疫苗；微小RNA145-5p在樹突狀細胞中過表達從而抑制免疫負調控作用的信號調控蛋白α的表達，增強了樹突狀細胞的適應性免疫活性。

本發明所述微小RNA145-5p的基因片段為成熟體微小RNA145，上下游各延長200個堿基，并在5’端和3’端加入限制性酶切位點，構建成微小RNA145-5p重組片段。

將含成熟體微小RNA145-5p基因序列24個堿基，及其上下游各200個堿基與5’端Kpn I和3’端EcoR I的識別序列構成的基因序列通過化學合成獲得，即mir145-5p；將mir145-5p的目的DNA片段重組到DNA載體質粒上，獲得可以穩定復制并序列正確的mir145-5p/pcDNA4。

本發明所述人未成熟樹突狀細胞，來源于人外周血、骨髓或臍帶血中單核細胞，經小鼠抗人抗CD14免疫磁珠分選獲得CD14陽性單核細胞，在重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、和重組人干細胞生長因子和重組人白介素4誘導培養得到的未成熟樹突狀細胞。