[發(fā)明專利]一種利用膠體金免疫層析試紙條檢測乳中TEM型β?內(nèi)酰胺酶的方法

在審

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• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN107490694A
• 公開（公告）日: 2017-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于國萍;范美婧;陳媛;藏小丹;岳崇慧;劉鵬;孫琪;董良偉
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/558
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用膠體金免疫層析試紙條檢測乳中TEM型β-內(nèi)酰胺酶的方法，屬于食 品檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

當前，牛奶中抗生素超標已成為影響牛奶食用安全的一個因素，一些不法商販將β-內(nèi)酰 胺酶加入牛奶中，β-內(nèi)酰胺酶能水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)構(gòu)活性中心-內(nèi)酰胺環(huán)使其失去活 性，掩蓋其抗生素超標的事實，這可能會使消費者對抗生素類藥物耐藥性增高，并且其水解 產(chǎn)物青霉噻唑酸會使有過敏體制的人出現(xiàn)不適反應。目前在我國易濫用的食品添加劑品種和 違法添加的非食品用物質(zhì)名單中就有β-內(nèi)酰胺酶。

β-內(nèi)酰胺酶分為4種(A-D類)，TEM型β-內(nèi)酰胺酶是最早被發(fā)現(xiàn)的一種β-內(nèi)酰胺酶，屬于 A類β-內(nèi)酰胺酶，并且已經(jīng)成為腸桿菌科中發(fā)現(xiàn)的最常見的β-內(nèi)酰胺酶，能夠有效地水解青霉 素。

為了提高我國乳制品的競爭力，加強乳制品安全性檢測，有必要建立快速有效的方法來 檢測乳制品中的β-內(nèi)酰胺酶。乳中β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法已有較多的研究，但這些方法的使 用均有一定的局限性。微生物法靈敏度高，但檢測時間長，操作技術(shù)要求高；碘量法的重現(xiàn) 性不好；酸定量法易受環(huán)境溫度影響；高效液相色譜的樣品前處理復雜且成本較高；頭孢噻 唑酚顯色法成本也較高。

膠體金現(xiàn)已廣泛用于農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域，例如用作免疫分析系統(tǒng)的標識物，應用于制備 免疫層析試紙條。免疫層析試紙條檢測因為其敏感性、快速性等優(yōu)勢而適用于進行現(xiàn)場檢測 的篩選工具。在快速檢測方面，張立靜等制備單克隆抗體和多克隆抗體，采用雙抗夾心法制 備了膠體金免疫層析試紙條。因為考慮到單克隆抗體的特異性較高，所以本文主要選取成對 的單克隆抗體，采用雙抗夾心法制備膠體金免疫層析試紙條用于檢測TEM型β-內(nèi)酰胺酶，為 不同種類乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法的建立提供參考依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

為完善現(xiàn)有的技術(shù)，本發(fā)明提供了一種利用膠體金免疫層析試紙條檢測乳中TEM型β- 內(nèi)酰胺酶的方法，用于檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶，本課題利用免疫膠體金分析法制備膠體金免 疫層析試紙條，優(yōu)化試紙條的制備過程，確定試紙條的靈敏度。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

本發(fā)明制備了β-內(nèi)酰胺酶膠體金免疫層析試紙條，用于檢測牛奶中的β-內(nèi)酰胺酶。采用 Frens方法制備膠體金，利用目測法、紫外掃描、透射電鏡鑒定膠體金顆粒的大小、均勻度、 分散性。通過Mey氏穩(wěn)定化實驗確定能使膠體金溶液穩(wěn)定的最適抗體濃度及最適pH值，確 定好后進行低溫高速離心制備金標抗體，利用目測法、可見光分光光度法、斑點金免疫滲濾 試驗鑒定金標抗體標記效果及是否具備活性，優(yōu)化金標抗體的制備過程。確定檢測線和質(zhì)控 線上一抗二抗的稀釋倍數(shù)，在NC膜上劃線檢測。選擇四種常見的NC膜進行性能測試，金 標墊、吸水紙、PVC板和樣品墊做統(tǒng)一選擇。

組裝試紙條，用劃膜儀在試紙條NC膜上進行劃線，劃線量為1μL/cm，T/C線距離5mm， 劃線后烘干處理，切成3mm寬的試紙條。樣品檢測時，復溶的金標抗體與樣品反應3min制 備成混合物，再用試紙條插入混合物中，檢測試紙條的靈敏度檢測及穩(wěn)定性，確定最低檢測 限及保存時間。

附圖說明

圖1膠體金透射電鏡圖

圖2最適標記pH值的確定

圖3最適標記抗體添加量的確定

圖4紫外掃描圖

圖5β-內(nèi)酰胺酶試紙條的靈敏度(IU/mL)

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技 術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應涵蓋在本發(fā)明 的保護范圍中。

一、膠體金的制備及鑒定

目測制得的膠體金顏色呈酒紅色，透明無沉淀，質(zhì)量較好。從紫外掃描圖圖4可知，最 大吸收峰峰值為523nm，根據(jù)最大吸收波長和粒徑之間的公式Y(jié)＝0.4271X+514.56(X： λmax,Y：納米金平均粒徑)，計算出平均直徑為20nm。如圖1為透射電鏡下(200nm)觀察到 的膠體金顆粒，大小基本一致,且分散性比較好，沒有聚集現(xiàn)象，最終測得膠體金顆粒平均直 徑約為20.6nm，與紫外測得結(jié)果基本一致。

二、金標抗體的制備與純化