[發明專利]一種軸向單分子高精度定位方法和裝置

在審

• 申請號: 201710341359.9
• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN108872164A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 賈策;徐濤;付彥輝;張翔;紀偉;羅志勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G02B21/00;G02B21/36
• 代理公司: 成都方圓聿聯專利代理事務所(普通合伙) 51241
• 代理人: 曹少華

本發明屬于超分辨定位熒光成像技術領域，涉及一種軸向單分子高精度定位的熒光定位方法裝置及其使用方法。本發明結合單分子定位的高精度特點，利用單分子軸向高斯光強分布響應曲線在焦點處斜率最大的特性，實現了單分子軸向的精確定位，繼而實現了超分辨熒光成像。本發明包括激光器A、激光器B、物鏡、三維樣品位移臺、軸向定位系統等；激光器A和激光器B用于對熒光分子的激發和激活。其中軸向定位系統由分光棱鏡、透鏡和EMCCD組成，熒光進入軸向定位系統后，經透鏡后成像在EMCCD處；EMCCD位置相對焦點是對稱的。

技術領域

本發明屬于超分辨定位熒光成像技術領域，涉及一種軸向單分子高精度定位的熒光定位方法裝置及其使用方法。

背景技術

現代生物醫學研究中為了更好地理解生命的作用過程和疾病的產生機理，往往需要觀察細胞內的細胞器、病毒、寄生蟲等在三維細胞空間的精確定位和分布情況。與此同時，蛋白質科學研究也要求闡明蛋白質結構、定位與功能的關系以及蛋白質-蛋白質之間發生相互作用的時空順序；生物大分子，主要是結構蛋白與RNA及其復合物，是如何組成細胞基本結構體系的；重要的活性因子是如何調節細胞內主要生命活動的，如細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化與細胞信號傳遞等。反映這些體系性質的特征尺度都在納米量級，雖然應用傳統的電子顯微鏡可以在納米量級分辨率觀察到細胞內囊泡、線粒體等細胞器的定位，但由于缺乏特異性的探針標記，不適合定位單個蛋白質分子，也不適合觀察活細胞和細胞膜的動態變化過程。因此，生物學家迫切希望有一種顯微實驗方法，在不影響生物活性的情況下，它既具有亞微米甚至納米尺度的光學分辨本領，又可以連續監測生物大分子和細胞器微小結構的演化過程。

近年來，在熒光顯微鏡領域，隨著新型熒光分子探針的出現和成像方法的不斷改進，超分辨顯微成像技術由于突破了衍射極限，達到了可以與電子顯微鏡相媲美的精度及數十納米的分辨率。目前常用的超分辨熒光技術是以納米級空間分辨率直觀顯示單分子空間分布情況并利用熒光分子本身的開關效應來進行定位的顯微成像技術，該技術在不同時刻獲取稀疏分布的被熒光分子標記的單分子定位信息，然后將不同時刻獲得的定位信息疊加，最終實現高橫向納米分辨率。單分子定位是超分辨熒光成像過程中不可缺少的環節，而實現軸向高分辨率是一個待解決的問題。

本發明人提出了一種新型的軸向單分子高精度定位方法，利用本技術方法不僅提高了軸向分辨率，而且有效地對偏移量和偏移方向進行了指定。

本發明以光強作為數據信息，且不易受環境干擾，將本技術應用于單分子定位，相比以往的測量方法具有精度高、抗干擾能力強等諸多優點。

發明內容

(一)要解決的技術問題

為了克服現有單分子技術中軸向分辨率低的不足，本發明提出了一種基于單分子軸向定位法的超分辨熒光成像方法和裝置。本發明結合單分子定位的高精度特點，利用單分子軸向高斯光強分布響應曲線在焦點處斜率最大的特性，實現了單分子軸向的精確定位，繼而實現了超分辨熒光成像。

本發明的目的是要解決單分子定位系統軸向分辨率低的問題，提出了一種利用焦面對稱接收信息精確定位熒光分子軸向位置的方法和裝置。

本發明的目的是通過下述技術方案實現的。

(二)技術方案

本發明提出了一種軸向單分子高精度定位方法，包括以下步驟：

(a)首先將實驗樣品的位置調整到顯微鏡物鏡焦平面上；

(b)然后激光A低能量照射實驗樣品表面，激活出焦面處的幾個熒光分子，激光B照射樣品激發出熒光分子，位移臺在焦面處上下各移動200nm，EMCCD記錄下各處圖像，再使用激光B長時間照射樣品對熒光分子進行漂白，之后分別用激光A和激光B來激活和漂白其他的熒光分子，并進入下一個循環，當循環持續上百次后，得到樣品內熒光分子在軸向的圖像；