[發(fā)明專利]一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710337975.7
• 申請日: 2017-05-15
• 公開（公告）號: CN107058421B
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張哲;李宏勝;楊峰;李新圃;羅金印;王旭榮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C08B37/00;C12R1/445
• 代理公司: 北京中恒高博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11249
• 代理人: 姜司晨

本發(fā)明公開了一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，包括以下步驟：336型金黃色葡萄球菌發(fā)酵培養(yǎng)、滅活、離心，從上清液和菌體沉淀中提取莢膜多糖粗制品，再將粗制品脫蛋白后用分子篩排阻層析對其純化，得到精制莢膜多糖。本發(fā)明的有益效果為：采用液體發(fā)酵培養(yǎng)，易于工藝放大與實際生產(chǎn)應(yīng)用；分別從發(fā)酵上清液和菌體沉淀中提取多糖，提高了莢膜多糖的生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本；使用Sevage法除蛋白，減少了苯酚的用量，同時減少了操作時間，提高了純化效率；多糖產(chǎn)量穩(wěn)定，純化后的精制多糖符合相關(guān)國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；方法簡便、有效，提取的莢膜多糖適用于疾病的診斷、預(yù)防和治療，適用于336型金黃色葡萄球菌莢膜多糖疫苗的制備。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法。

背景技術(shù)

奶牛乳房炎是奶牛生產(chǎn)中最為常見、最難防治，同時也是花費(fèi)最多的疾病之一，嚴(yán)重影響了我國乃至世界奶牛業(yè)的健康發(fā)展。根據(jù)世界奶牛協(xié)會統(tǒng)計，全世界約有2.2億頭奶牛，其中約50%患有乳腺炎等，全球每年因乳房炎造成的損失約350億美元。乳房炎是乳腺組織的一種炎癥，常由微生物感染引起，已有超過150種微生物被認(rèn)為能導(dǎo)致奶牛乳房炎的發(fā)生，其中金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的最主要致病菌之一。隨著多重耐藥性金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)和流行，以及人們對于奶制品中抗生素殘留的日益重視，研究和使用疫苗無疑是預(yù)防金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎的一種有效手段。

金黃色葡萄球菌之所以難以防治，是因為在菌體的表面存在一層“保護(hù)膜”，即莢膜。有研究表明，莢膜幾乎存在于所有金黃色葡萄球菌菌株的表面，可保護(hù)細(xì)菌免受抑菌或殺菌物質(zhì)的侵害以及宿主吞噬細(xì)胞的吞噬，同時還有助于細(xì)菌黏附于宿主細(xì)胞表面以誘發(fā)感染，是細(xì)菌得以生存的重要表面結(jié)構(gòu)。莢膜的主要成分為多糖，是細(xì)菌結(jié)構(gòu)變化最少的表面抗原之一，具有較好的免疫原性。據(jù)報道，94%～100%的金黃色葡萄球菌都含有莢膜，因此提取金黃色葡萄球菌莢膜多糖作為其疫苗的靶抗原已備受關(guān)注。目前，已被鑒定的金黃色葡萄球菌有11個莢膜多糖血清型，其中70％～80％的金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生5型或8型莢膜多糖。然而，近年來多項研究表明，336型已成為我國奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的優(yōu)勢血清型，因此對于336型金黃色葡萄球菌多糖疫苗的研究，也越來越重要。

不論是莢膜多糖疫苗還是多糖蛋白結(jié)合疫苗的研制，莢膜多糖的提取與純化是其中的關(guān)鍵步驟之一。目前，關(guān)于金黃色葡萄球菌莢膜多糖提取的報道有很多，但提取方法各異。楊正濤等采用固體培養(yǎng)基對5型金葡菌莢膜多糖進(jìn)行培養(yǎng)，收集菌體經(jīng)高壓裂解釋放莢膜多糖，但固體培養(yǎng)法不利于擴(kuò)大生產(chǎn)。楊琦采用了液體發(fā)酵離心收集菌體，高壓裂解菌體收集上清液，再往上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）以沉淀多糖，純化后多糖產(chǎn)量為1.3mg/L；吳建勇等采用液體發(fā)酵培養(yǎng)，離心收集菌體沉淀經(jīng)溶菌酶裂解菌體，采用乙醇沉淀對金黃色葡萄球菌336型莢膜多糖進(jìn)行了提取純化。中國專利CN 102971009 A，公開了5型和8型金黃色葡萄球菌莢膜多糖的提取純化工藝，該發(fā)明使用了酸處理金黃色葡萄球菌以釋放多糖。然而，林樹乾利用金黃色葡萄球菌發(fā)酵上清液，也成功提取到了莢膜多糖，經(jīng)純化后，多糖產(chǎn)量為12.5mg/L。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，克服現(xiàn)有技術(shù)純化金黃色葡萄球菌莢膜多糖的局限，采用液體發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)甲醛滅活離心后分別對上清及菌體中的多糖進(jìn)行提取，以提高莢膜多糖產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本；同時，利用Sevage法替代傳統(tǒng)工藝中苯酚抽提去除蛋白質(zhì)的方法，減少了苯酚的用量，提高了多糖純化效率。

本發(fā)明所采用336型金黃色葡萄球菌，分離自患臨床型奶牛乳房炎的乳樣中，其特點為菌株傳代穩(wěn)定性好，毒力強(qiáng)，莢膜多糖產(chǎn)量高。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，包括以下步驟：

1）發(fā)酵培養(yǎng)：