[發明專利]一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法

有效

• 申請號: 201710337975.7
• 申請日: 2017-05-15
• 公開（公告）號: CN107058421B
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 張哲;李宏勝;楊峰;李新圃;羅金印;王旭榮
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C08B37/00;C12R1/445
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 姜司晨

1.一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）發酵培養：

將336型金黃色葡萄球菌種子液按體積百分比1%的接種量接種到pH為7 .0的裝有哥倫比亞培養基的三角搖瓶中，37℃，200rpm/min搖床震蕩培養16～18h，收獲得到發酵液；

2）滅活：

將步驟1）得到的發酵液中，按終體積的以體積百分比計0 .3%加入甲醛溶液，置37℃搖床滅活20～24h，經滅活檢測合格后備用，得到滅活發酵液；

3）提取莢膜多糖：

將步驟2）得到的滅活發酵液低溫離心，采用陽離子去垢劑從發酵上清液中提取莢膜多糖，采用高壓裂解法從菌體沉淀中提取莢膜多糖；

4）純化莢膜多糖：

采用分子Sevage法抽提多糖中的蛋白質，并利用分子篩排阻層析對脫蛋白的莢膜多糖溶液做進一步純化；

所述步驟1）中，金黃色葡萄球菌的培養中所使用的哥倫比亞培養基中，添加有按照體積百分比計為2%的無菌乳清；

所述步驟3）中的滅活發酵液低溫離心，是指溫度為4℃，離心轉速為5000rpm/min，離心時間為20min，收集上清液，菌體沉淀置-20℃保存備用；

所述步驟3）中的采用陽離子去垢劑從發酵上清液中提取莢膜多糖，是指向離心后得到的發酵上清液中加入陽離子去垢劑，邊加邊攪拌，4℃靜置過夜沉淀多糖；沉淀用1M的CaCl₂溶液溶解，加入冷無水乙醇至終濃度為按體積百分比計25%，震蕩混勻后4℃靜置過夜；4℃，5000rpm/min離心20min棄沉淀，上清液中加入冷無水乙醇至終濃度為按體積百分比計80%，4℃靜置過夜；4℃，5000rpm/min離心20min，收集沉淀，用無水乙醇和丙酮洗滌后凍干，即得到莢膜多糖粗制品；

所述步驟3）中的采用高壓裂解法從菌體沉淀中提取莢膜多糖，是指將離心后得到的菌體沉淀懸浮于PBS緩沖液中，高壓裂解后，4℃，5000rpm/min離心20min，收集上清液，沉淀再次高壓裂解并離心，合并裂解上清液；將所得上清液用10KD超濾膜超濾濃縮；加入冷的無水乙醇至終濃度為按體積百分比計25%，震蕩混勻后4℃靜置過夜；4℃，5000rpm/min離心2 0m i n取上清，加入冷無水乙醇至終濃度為按體積百分比計8 0 % ，4℃靜置過夜，4℃，5000rpm/min離心20min收集沉淀，用無水乙醇和丙酮洗滌后凍干，即得到莢膜多糖粗制品；

所述步驟4）中，采用分子Sevage法抽提多糖中的蛋白質，是指合并步驟3）中提取得到的兩種莢膜多糖粗品，用注射用水溶解至多糖粗制品的終濃度為10 mg/ml，加入1/3體積的氯仿與正丁醇體積比為4:1的Sevage試劑，充分震搖25 min后，4℃，5000rpm/min離心20min，上清液經30KD超濾管超濾后凍干后，得到脫蛋白的多糖；利用分子篩排阻層析對脫蛋白的莢膜多糖溶液做進一步純化，是指利用分子篩排阻層析對脫蛋白的莢膜多糖溶液進行純化，收集峰值處及附近的洗脫液，30KD超濾管進行超濾后低壓凍干，得到白色粉末狀物質即為莢膜多糖純品。

2.根據權利要求1所述的一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，其特征在于，所述步驟3）中，陽離子去垢劑為十六烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基氯化銨或十四烷基二甲基芐基氯化銨。

3.根據權利要求1所述的一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，其特征在于，所述步驟4）中，采用的分子篩排阻層析填料為Sepharose 2B，Sepharose 4B，Sepharose CL-2B，Sepharose CL-4B或superdex 200。