[發明專利]一種產蝦青素基因工程菌的構建方法

在審

• 申請號: 201710335486.8
• 申請日: 2014-09-03
• 公開（公告）號: CN107129995A
• 公開（公告）日: 2017-09-05
• 發明（設計）人: 劉天罡;馬田;朱發銀;周袁杰
• 申請（專利權）人: 武漢生物技術研究院;武漢大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12R1/19;C12P23/00
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙)42222
• 代理人: 彭勁松

本發明專利申請是申請號為“2014104472590”的發明專利的分案申請，原申請的申請日為“2014.09.03”，申請號為“2014104472590”，發明名稱為“鞘氨醇單胞菌的蝦青素合成酶及其編碼基因和鞘氨醇單胞菌遺傳操作的方法”。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種產蝦青素基因工程菌的構建方法。

背景技術

蝦青素（Astaxanthin，又稱變胞藻黃素或蝦紅素），屬于酮式類胡蘿卜素，是一種較強的天然抗氧化劑。其獨特的分子結構不但使其具有超強的抗氧化活性，還具有抗衰老、抗輻射、抗腫瘤及預防心腦血管疾病的作用。目前，蝦青素已在食品、飼料、保健品市場等廣泛應用。然而天然蝦青素的來源非常有限，目前，蝦青素大多采用傳統突變技術產生的Pfaffia菌株和微藻生產，但是，Pfaffia發酵存在發酵周期長的缺點，而從藻類中獲得產物的生產技術仍不成熟。因此，開發新的天然蝦青素資源具有重要意義。

鞘氨醇單胞菌是革蘭氏陰性菌，1990年被鑒定，專性需氧，以單側生極性鞭毛運動，多呈黃色。其黃色菌落多是由于產生類胡蘿卜素導致。細胞膜與一般的革蘭氏陰性菌不同，為鞘糖脂，這也使得對其的遺傳操作還未成熟。目前，在Sphingomonas ATCC 55669中尚無任何基因方面的信息報道，也未有相關遺傳操作的文獻，即使是該菌株所在的屬也鮮有報道。目前，鞘氨醇單胞菌多可降解多元化的芳環化合物，是環境微生物的研究熱點，其遺傳操作的建立為進一步利用其降解機制建立了基礎。

蝦青素生物合成途徑已被廣泛研究并取得了巨大進展，大量關鍵酶基因得到克隆。目前已知的類胡蘿卜素均通過類異戊二烯化合物或萜類化合物途徑合成。其中，非甲羥戊酸途徑MEP（nonmevalonate pathway）途徑廣泛存在于細菌中，它以糖酵解中間代謝物丙酮酸和3-磷酸甘油醛為前體，在脫氧木酮糖磷酸合酶作用下生成脫氧木酮糖磷酸，然后受脫氧木酮糖磷酸還原酶和異構酶催化，通過還原和異構反應將脫氧木酮糖磷酸轉變成2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）。經胞苷三磷酸活化，腺苷三磷酸磷酸化，從而形成甲基赤蘚糖醇環化焦磷酸，然后轉變成IPP（異戊烯焦磷酸），IPP 異構化形成DMAPP（二甲基丙烯基二磷酸）。IPP和DMAPP是合成蝦青素途徑的前體物質。兩者在IPP異構酶作用下相互轉換達到平衡，在crtE（牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶）作用下，1個DMAPP與3個IPP 分子縮合生成GGPP（牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸）。2分子GGPP在crtB（八氫番茄紅素合成酶）作用下形成第一個無色的類胡蘿卜素——八氫番茄紅素。八氫番茄紅素經過連續的脫氫步驟（crtI）生成番茄紅素。番茄紅素在crtY（番茄紅素β-環化酶）的作用下生成β-胡蘿卜素。β-胡蘿卜素在crtZ（β-胡蘿卜素羥化酶）和crtW（β-胡蘿卜素酮酶）的一系列作用下生成蝦青素（如圖1）。

通過豐富不同來源的蝦青素生物合成相關基因，經重組DNA技術篩選，從而增加蝦青素生物合成的生產能力，是縮短發酵周期，提高蝦青素生物合成產率的重要途徑，從而為蝦青素進一步工業化生產打下基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種產蝦青素基因工程菌的構建方法以及通過該方法得到的基因工程菌。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種產蝦青素基因工程菌的構建方法，包括如下步驟：將產蝦青素質粒pFZ153轉化內含質粒pMH1、pFZ81的MG1655大腸桿菌感受態細胞，得到產蝦青素基因工程菌；其中，產蝦青素質粒pFZ153通過包括如下步驟的方法得到：

（1）大腸桿菌來源的idi基因通過PCR擴增克隆到載體pET28a（+）上獲得質粒pGZI，將idi基因片段從pGZI中用NdeI和XhoI切下插入到pETduet-1相應位點獲得pFZ87。

（2）以pFZ87為模板用引物PagCrtY-Idi-R和PagCrtW-pETduet-F擴增質粒骨架；

從CGMCC 1.2244基因組DNA擴增crtY和crtZ，引物分別為Idi-PagCrtY-F、CrtZ-PagCrtY-R，CrtY-PagCrtZ-F、CrtW-PagCrtZ-R；

合成SEQ ID NO.1所示的CrtW，以其為模板用引物CrtZ-BreCrtW-F和BreCrtW-R擴增crtW；