[發明專利]一種產蝦青素基因工程菌的構建方法

在審

• 申請號: 201710335486.8
• 申請日: 2014-09-03
• 公開（公告）號: CN107129995A
• 公開（公告）日: 2017-09-05
• 發明（設計）人: 劉天罡;馬田;朱發銀;周袁杰
• 申請（專利權）人: 武漢生物技術研究院;武漢大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12R1/19;C12P23/00
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙)42222
• 代理人: 彭勁松

1.一種產蝦青素基因工程菌的構建方法，其特征在于：包括如下步驟：將產蝦青素質粒pFZ153轉化內含質粒pMH1、pFZ81的MG1655大腸桿菌感受態細胞，得到產蝦青素基因工程菌；其中，產蝦青素質粒pFZ153通過包括如下步驟的方法得到：

（1）大腸桿菌來源的idi基因通過PCR擴增克隆到載體pET28a（+）上獲得質粒pGZI，將idi基因片段從pGZI中用NdeI和XhoI切下插入到pETduet-1相應位點獲得pFZ87；

（2）以pFZ87為模板用引物PagCrtY-Idi-R和PagCrtW-pETduet-F擴增質粒骨架；

從CGMCC 1.2244基因組DNA擴增crtY和crtZ，引物分別為Idi-PagCrtY-F、CrtZ-PagCrtY-R，CrtY-PagCrtZ-F、CrtW-PagCrtZ-R；

合成SEQ ID NO.1所示的CrtW，以其為模板用引物CrtZ-BreCrtW-F和BreCrtW-R擴增crtW；

crtY、crtZ、crtW和質粒骨架四個片段用Giboson方法連接獲得pFZ152；

（3）將合成序列分別如SEQ ID NO.2、3、4所示的crtE、crtB和crtI，將crtE、crtB和crtI分別克隆到pET28a(+)的NdeI和EcoRI位點獲得pFZ21、pFZ22和pFZ23；

（4）以構建pFZ152同樣的方法分別以pFZ87、pFZ21、pFZ22、pFZ23為模板用引物PETduet-NcoI-R、pETduet-EcoRI-T7-F，Duet-PanCrtE-F、PanCrtI-CrtE-R，PanCrtE-CrtI-F、PanCrtB-CrtI-R，PanCrtI-CrtB-F、Duet-EcoRI-PanCrtB-R擴增質粒骨架、crtE、crtI和crtB，用Giboson方法連接獲得質粒pFZ112；

（5）將crtE-crtI-crtB用NdeI和EcoRI從pFZ112上切下插入到pFZ152對應的位點獲得產蝦青素質粒pFZ153；

上述各引物序列如下：

PagCrtY-Idi-R:CAGATCATACCGCGGCATAGTGTAATCCTCCTTTATTTAAGCTGGGTAAATG，

PagCrtW-pETduet-F:CTTATGGCGTGGTGAGAGCTAACTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGC，

Idi-PagCrtY-F:ACCCAGCTTAAATAAAGGAGGATTACACTATGCCGCGGTATGATCTGATTC，

CrtZ-PagCrtY-R:GCATTCCAAATCCACAACATATAGTAATCCTCCTTCATTGCATCGCCTGTTGAC，

CrtY-PagCrtZ-F:CAGGCGATGCAATGAAGGAGGATTACTATATGTTGTGGATTTGGAATGCCCTGA，

CrtW-PagCrtZ-R:CCACTGCGGCGGTCATTACTCATTCCTCCTTTACTTCCCGGGTGGCGCGTC，

CrtZ-BreCrtW-F:CGCCACCCGGGAAGTAAAGGAGGAATGAGTAATGACCGCCGCAGTGGCAGAG，

BreCrtW-R: GCGGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTAGCTCTCACCACGCCATAAG，

PETduet-NcoI-R: CATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC，

pETduet-EcoRI-T7-F: TAACTAGTGAATTCGAGCTCGGCGCGCCTG，

Duet-PanCrtE-F:GAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGACCGTGTGTGCGAAAAAAC，

PanCrtI-CrtE-R:TCACCGTGGTCGGTTTCATGGTTAATTCCTCCTTTACGACACCGCTGCCAG，

PanCrtE-CrtI-F:CTGGCAGCGGTGTCGTAAAGGAGGAATTAACCATGAAACCGACCACGGTGA，

PanCrtB-CrtI-R:TCAGCAGGGACGGATTATTCATGAGTATTACCTCCTTTAAATCAGGTCTTCCAGCATC，

PanCrtI-CrtB-F:GATGCTGGAAGACCTGATTTAAAGGAGGTAATACTCATGAATAATCCGTCCCTGCTGA，

Duet-EcoRI-PanCrtB-R:TTGTCGACCTGCAGGCGCGCCGAGCTCGAATTCACTAGTTAAACGGGGCGCTGCCAGAG。

2.一種產蝦青素基因工程菌，其特征在于：通過權利要求1所述的方法得到。