[發明專利]一種斜帶石斑魚CCR12的多克隆抗體制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201710333721.8
• 申請日: 2017-05-04
• 公開（公告）號: CN107312092B
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 但學明;李言偉;周玲
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N15/70;C07K14/715
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一種斜帶石斑魚CCR12的多克隆抗體制備方法及其應用。目前在魚中發現了3種XCR1樣趨化因子受體，即XCR1、XCR1L和CCR12，其中XCR1L和CCR12只在魚類基因組中發現，但關于其功能研究甚少，截止目前，尚未有關于魚類CCR12體外表達的任何報道，尚未有人制備過斜帶石斑魚的CCR12多克隆抗體，關于CCR12多克隆抗體的應用更無任何報道。為進一步揭示石斑魚CCR12陽性細胞在寄生蟲感染組織中的遷移或增殖情況，鑒定CCR12陽性細胞類型，本研究首次通過原核系統表達純化了CCR12的N?端區和3個胞外區重組蛋白，并最終首次制備了兔抗CCR12重組蛋白多克隆抗體，該抗體能特異性識別石斑魚CCR12蛋白，且標記血液中的細胞，為我們今后標記CCR12陽性細胞并開展其抗寄生蟲感染研究奠定基礎。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種斜帶石斑魚CCR12的多克隆抗體制備方法及其應用。

背景技術

趨化因子是一類分子量非常小的細胞因子，他們具有相似的單體結構(Baggiolini，1998；Jin et al.，2005)。根據其結構和4個保守半胱氨酸的排列順序，可將趨化因子分為：CXC型、CC型、XC型、CX3C型和CX型等5類(Murphy，et al.，2000；Nomiyama etal.，2008)。趨化因子行使功能時，需要與其相應的受體結合。XCL1是一種XC型趨化因子，在穩態、病原感染或炎癥反應時，由胸腺髓樣上皮細胞、或激活的T細胞、NK細胞、以及NKT細胞產生(Lei et al.，2012)。XCR1是XCL1唯一的受體，由CD8α⁺和CD11b^-CD103⁺DC細胞分泌(Alexandre et al.，2013)。XCL1-XCR1軸在維持內穩態、調節性T細胞產生、以及DC細胞介導的細胞毒性反應中都起到重要作用(Lei et al.，2012)。此外，XCL1-XCR1軸還參與感染和自生免疫疾病。

目前，鼠基因組中只鑒定到XCL1這一種趨化因子XC亞家族成員，但在人基因組中鑒定到XCL1和XCL2兩種(DeVries et al.，2006；Fox et al.，2015)。XCL1是哺乳動物和鳥中普遍存在的趨化因子，但XCL2僅僅在一些物種中存在(Nomiyama et al.，2011)。在魚中，目前尚未鑒定到XCL1或XCL2同源蛋白，但發現了3種XCR1樣趨化因子受體，即XCR1、XCR1L和CCR12(Grimholt et al.，2015；Nomiyama et al.，2011)。其中XCR1L和CCR12只在魚類基因組中發現，但關于其功能研究甚少，且抗XCR1L或CCR12抗體的缺乏也限制了對其陽性細胞的分離及功能的研究。截止目前，尚未有關于魚類CCR12體外表達的任何報道，更無關于CCR12多克隆抗體的研究。

我們研究發現：刺激隱核蟲感染后，石斑魚CCR12在皮膚、鰓和脾臟中的表達量顯著增加，推測CCR12陽性細胞參與石斑魚抗寄生蟲感染過程。為進一步揭示石斑魚CCR12陽性細胞在寄生蟲感染組織中的遷移或增殖情況，鑒定CCR12陽性細胞類型，本研究首次構建了石斑魚CCR12胞外區表達載體，首次通過原核系統表達純化了CCR12的N-端區和3個胞外區重組蛋白，并最終首次制備了兔抗CCR12重組蛋白多克隆抗體，該抗體能特異性識別石斑魚CCR12蛋白，且標記血液中的細胞，為我們今后標記CCR12陽性細胞并開展其抗寄生蟲感染研究奠定基礎。

發明內容

到目前為止，尚未有人制備過斜帶石斑魚的CCR12多克隆抗體，關于CCR12多克隆抗體的應用更無任何報道，而本發明通過基因工程方法，首次成功表達純化了斜帶石斑魚CCR12，并首次制備了兔抗CCR12重組蛋白多克隆抗體，同時對其初步應用也進行了一定研究。

本發明的目的在于提供一種斜帶石斑魚CCR12的多克隆抗體制備方法及其應用，具體步驟如下：

(一)石斑魚CCR12基因克隆及序列分析：

1、石斑魚脾臟總RNA的提取