[發(fā)明專利]一種斜帶石斑魚CCR12的多克隆抗體制備方法及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2017-05-04
• 公開（公告）號: CN107312092B
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 但學(xué)明;李言偉;周玲
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N15/70;C07K14/715
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1.一種斜帶石斑魚CCR12的多克隆抗體制備方法，其特征在于，步驟如下：

(一)石斑魚CCR12的原核表達(dá)及純化：

I、CCR12重組表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)目的片段擴(kuò)增；

a.通過SMART軟件分析，斜帶石斑魚CCR12是一種七次跨膜蛋白，由一個N-端區(qū)、3個胞外區(qū)、3個胞內(nèi)區(qū)和一個C-端區(qū)構(gòu)成；選擇斜帶石斑魚CCR12的N-端區(qū)和3個胞外區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；

b.以CCR12N端正向引物/反向引物、CCR12胞外區(qū)1正向引物/反向引物、CCR12胞外區(qū)2正向引物/反向引物和CCR12胞外區(qū)3正向引物/反向引物為引物，以石斑魚cDNA為模板，用高保真酶PrimeSTAR^TMMix分別擴(kuò)增CCR12的N-端區(qū)和3個胞外區(qū)；

c.再以CCR12N端正向引物/胞外區(qū)1反向引物為引物，步驟b擴(kuò)增的CCR12N-端區(qū)和第1個胞外區(qū)為模板，通過重組PCR連接N-端區(qū)和第1個胞外區(qū)；同時，以CCR12胞外區(qū)2正向引物/胞外區(qū)3反向引物為引物，以步驟b擴(kuò)增的CCR12的第2和第3個胞外區(qū)為模板，通過重組PCR連接第2和第3個胞外區(qū)；

d.最后，以CCR12N端正向引物/胞外區(qū)3反向引物為引物，以步驟c連接成功的兩個融合片段為模板，通過重組PCR將CCR12的N-端區(qū)和3個胞外區(qū)連接到一起，膠回收目的片段；

其中，引物CCR12N端正向引物的序列為CGGGATCCATGAGCGACGAATTTCTGCT，引物CCR12N端反向引物的序列為AGAACCACCGCCGCCAAATTTCGCACCAAAGTGG，擴(kuò)增片段為41bp；引物CCR12胞外區(qū)1正向引物的序列為GGCGGCGGTGGTTCTCATCTGTCTGAATGG，引物CCR12胞外區(qū)1反向引物的序列為AGAACCACCGCCGCCGTAGGCACTGCTGAC，擴(kuò)增片段為87bp；引物CCR12胞外區(qū)2正向引物的序列為GGCGGCGGTGGTTCTAAAAATGTGGGTAGCA，引物CCR12胞外區(qū)2反向引物的序列為GCTGCCACCGCCACCGAATTGCTGGTAATA，擴(kuò)增片段為135bp；引物CCR12胞外區(qū)3正向引物的序列為GGTGGCGGTGGCAGCGCTATTCAGATCTC，引物CCR12胞外區(qū)3反向引物的序列為CCGCTCGAGTCACGCATAGTCCAAGCTCT，擴(kuò)增片段為96bp；引物序列中下劃線部分表示酶切位點(diǎn)；

(2)表達(dá)載體的提取；(3)雙酶切目的片段和表達(dá)載體；(4)重組表達(dá)載體構(gòu)建：通過菌落PCR法鑒定陽性克隆，并進(jìn)行測序；

II、CCR12重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

(1)CCR12重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；

(2)CCR12重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化；

a.IPTG濃度的優(yōu)化；b.誘導(dǎo)時間的優(yōu)化；

III、CCR12重組蛋白的純化；

(二)斜帶石斑魚CCR12的多克隆抗體制備：

I、CCR12多克隆抗體制備：

(1)將兩只新西蘭雄兔在無菌動物房適應(yīng)飼養(yǎng)2周；

(2)取約2mg CCR12重組蛋白，加入PBS至2ml，加入2ml弗氏完全佐劑，反復(fù)推拉共軛注射器使CCR12重組蛋白乳化；

(3)用無菌注射器吸取已與弗氏完全佐劑乳化的CCR12重組蛋白，先用75％酒精棉對新西蘭雄兔多個注射位點(diǎn)消毒，再進(jìn)行皮下注射，注射劑量為1ml/只；

(4)兩周后，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以初始免疫一半CCR12重組蛋白量與等量的弗氏不完全佐劑乳化混勻后，對新西蘭雄兔進(jìn)行皮下注射，共加強(qiáng)免疫3次，每次間隔時間均為2周；

(5)最后一次加強(qiáng)免疫7天后，對免疫新西蘭雄兔進(jìn)行頸動脈采血，室溫靜置2h，4℃過夜，4℃、4000r/min離心30min后小心吸取上層血清，56℃處理30min以滅活補(bǔ)體，用proteinA柱子進(jìn)行純化，分裝后-20℃保存；

II、ELISA測定多抗效價；

III、Western blotting檢測多抗的特異性：

(1)提取斜帶石斑魚頭腎的總蛋白和膜蛋白；

(2)多抗的特異性檢測：

a.抗原蛋白SDS-PAGE電泳后，將凝膠按照點(diǎn)樣泳道切割成適當(dāng)大小浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中；

b.將PVDF膜裁剪成與凝膠相匹配的大小，浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中；

c.按照黑板即負(fù)極、泡沫墊、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、泡沫墊、白板即正極的順序固定凝膠和PVDF膜，注意排除氣泡；

d.將裝置放入轉(zhuǎn)印槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，100V轉(zhuǎn)膜23min；

e.轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取下PVDF膜，加入10％脫脂奶粉室溫封閉1h；

f.加入上述步驟(二)I制備的CCR12多克隆抗體，4℃孵育過夜；

g.棄去CCR12多克隆抗體，用PBST洗滌3次，每次5min；

h.加入用10％脫脂奶粉稀釋的二抗室溫孵育1h；

i.棄去二抗，用PBST洗滌3次；

j.用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯示拍照。