[發明專利]柑橘黃化脈明病毒免疫膠體金試紙條及其制備方法

在審

• 申請號: 201710333029.5
• 申請日: 2017-05-12
• 公開（公告）號: CN107014999A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 周常勇;賓羽;宋震;李中安
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙)50211
• 代理人: 鄒曉艷

技術領域

本發明屬于病毒診斷技術領域，具體涉及一種柑橘黃化脈明病毒免疫膠體金試紙條及其制備方法。

背景技術

柑橘黃化脈明病(Yellow vein clearing disease，YVCD)自1988年在巴基斯坦的檸檬和酸橙上首次發現以來，已在印度、土耳其和中國的局部地區相繼報道發生。該病主要為害檸檬和酸橙等柑橘屬植物，檸檬、酸橙感病后表現葉脈明化，并伴有葉片反卷和皺縮等癥狀，嚴重時葉脈壞死、嫩葉脫落、產量下降。柑橘黃化脈明病由柑橘黃化脈明病毒(Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV)引起，CYVCV為正義單鏈RNA病毒，病毒粒子呈彎曲線狀，屬于α線性病毒科(Alphaflexiviridae)柑橘病毒屬(Mandarivirus)。CYVCV基因組由7529個核苷酸組成，包含6個開放閱讀框(ORF)，整個基因組包裹于ORF5編碼的分子大小34kDa(325個氨基酸)的外殼蛋白CP中，不同地域和寄主中的CYVCV分離物基因組序列具有很低的差異性和一定的穩定性。

CYVCV可通過嫁接傳播到大多數柑橘屬植株以及機械摩擦接種到莧色藜(Chenopodiumamaranticolor)、昆諾藜(C.quinoa)、菜豆(Phaseolus vulgaris)和豇豆(Vigna unguiculata)，但不能通過種子傳播。CYVCV還可通過繡線菊蚜(Aphis spiraecola)和豆蚜(A.craccivora)在豆科植株間，以及從檸檬到豆科植株間進行傳播。周彥等通過調研檢測，發現該病毒在中國主要柑橘種植省份普遍存在，并指出該病在中國蔓延迅速，很可能是由于在柑橘與柑橘植株間的傳播也存在昆蟲媒介。隨著該病的發生范圍不斷擴大，給檸檬產業帶來極大損失，因此急需建立針對CYVCV快速、有效的檢測方法，從而正確掌握該病發生流行情況，構建科學防控體系。目前，CYVCV常用檢測方法包括電子顯微鏡檢測法、RT-PCR、實時熒光RT-PCR、直接組織點免疫法、反轉錄環介導等溫核酸擴增和酶聯免疫吸附法。然而，這些檢測方法都受限于檢測時間長，需要特殊的實驗儀器及操作技能等，不適用于基層單位和柑橘種植農戶等不具備試驗條件的用戶，因此建立一種操作簡便、快速及特異的CYVCV檢測方法具有重要的現實意義。

膠體金免疫層析法(Colloidal Gold Immunochromatography Assay,GICA)是一種將抗原抗體特異性反應、膠體金標記和免疫層析結合于一體的快速檢測方法，該方法與傳統的血清學檢測和PCR等分子生物學方法相比具有快速、簡便、無需特殊試驗設備及良好大田適應性等優勢。

發明內容

本發明的目的是提供一種特異性強、靈敏度高、檢測快速、操作簡單方便的柑橘黃化脈明病毒免疫膠體金試紙條及其制備方法。

一種柑橘黃化脈明病毒免疫膠體金試紙條，包括：樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和支持板；所述金標墊是結合有膠體金標記的柑橘黃化脈明病毒鼠源單克隆抗體1E1的玻璃纖維素膜；硝酸纖維素膜上的檢測線位置包被柑橘黃化脈明病毒鼠源單克隆抗體1E1，硝酸纖維素膜上的質控線位置包被羊抗鼠IgG。

前述的柑橘黃化脈明病毒免疫膠體金試紙條的制備方法，包括如下步驟：

(1)制備膠體金；

(2)制備金標抗體：利用膠體金和柑橘黃化脈明病毒鼠源單克隆抗體1E1制備得到膠體金標記抗體1E1復合物；

(3)將上述制備得到的膠體金標記抗體1E1復合物噴鋪于玻璃纖維素膜上，室溫干燥，即得金標墊；

(4)制備包被的硝酸纖維素膜：吸取柑橘黃化脈明病毒鼠源單克隆抗體1E1在硝酸纖維素膜上噴畫成為檢測線；吸取羊抗鼠IgG在硝酸纖維素膜上噴畫成為質控線，室溫干燥備用；

(5)將樣品墊、金標墊、噴畫有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼在支持板上，即得到柑橘黃化脈明病毒免疫膠體金試紙條。

步驟(1)中的膠體金為直徑30nm的膠體金。

步驟(3)中金標墊的具體制備方法為將抗體終濃度60μg/mL的金標抗體1E1復合物以6～7μL/cm²均勻地噴鋪于玻璃纖維素膜上。

步驟(4)中制備包被的硝酸纖維素膜的具體方法為吸取2.5mg/mL的單克隆抗體1E1以0.5μL/cm²噴畫1mm寬的檢測線；吸取0.85mg/mL的羊抗鼠IgG以0.5μL/cm²噴畫1mm寬的質控線。