[發(fā)明專利]一種楸樹遺轉化體系的構建方法

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• 申請日: 2017-05-11
• 公開（公告）號: CN107058374A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設計）人: 梁宏偉;劉佳;陳發(fā)菊;張德春;沈祥陵;劉文
• 申請（專利權）人: 三峽大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所42103
• 代理人: 成鋼

1.一種楸樹遺轉化體系的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）胚性愈傷組織的潮霉素臨界致死濃度的確定：將楸樹幼胚誘導的胚性愈傷組織接種到附加不同濃度的潮霉素的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)統(tǒng)計存活率，得到胚性愈傷組織的潮霉素臨界致死濃度；

2）農桿菌介導輔以超聲波處理進行侵染轉化：使用含有目的基因的農桿菌工程菌液對胚性組織進行侵染轉化，侵染的同時進行超聲波輔助處理；

3）侵染處理的胚性愈傷組織的共培養(yǎng)和選擇培養(yǎng)：經(jīng)過步驟2）侵染轉化后將胚性愈傷組織置于增殖培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)后轉置于選擇培養(yǎng)基中進行轉化子的選擇培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)過程中未轉化組織將被抗生素殺死，存活下來的抗性愈傷組織和再生植株可進行下一步的轉化檢測；

4）轉化愈傷組織的報告基因瞬時表達和再生植株的PCR檢測：對經(jīng)過步驟3）共培養(yǎng)后的胚性愈傷組織進行報告基因的瞬時表達檢測，對步驟3）選擇培養(yǎng)過程中獲得抗性再生植株進行PCR擴增檢測；

完成楸樹遺轉化體系的構建。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟1）選擇培養(yǎng)基為1/2MS固態(tài)培養(yǎng)基添加10-80mg/L的潮霉素。

3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟1）胚性愈傷組織的潮霉素臨界致死濃度的確定中培養(yǎng)時間為3周。

4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟2）制備好的農桿菌工程菌液重懸于1/2MS液體培養(yǎng)基中，菌液OD600值為0.4-0.7，工程菌液中添加0.01-100μmol/L乙酰丁香酮，胚性愈傷組織置于工程菌液中侵染處理10-30分鐘，侵染的同時將工程菌液和愈傷組織置于50ml離心管中進行超聲處理，超聲振幅15μm，超聲處理時間1-5分鐘。

5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于：所述步驟2）中的工程菌液制備和侵染轉化處理所需總時間為2.5天，其中2天制備工程菌液，0.5天時間完成超凈工作臺中的侵染轉化，完成侵染處理的胚性愈傷組織進行共培養(yǎng)。

6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟3）共培養(yǎng)是將經(jīng)步驟2）侵染后的胚性愈傷組織在黑暗條件下培養(yǎng)2-5天，選擇培養(yǎng)是在添加潮霉素和400mg/L羧芐青霉素作為除菌劑的1/2MS固態(tài)培養(yǎng)基中進行轉化子的篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)基中潮霉素濃度≤經(jīng)步驟1）確定的胚性愈傷組織潮霉素臨界致死濃度，所述潮霉素臨界致死濃度為60mg/L。

7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟3）中共培養(yǎng)時間為3天，選擇培養(yǎng)時間為4-8周以上直至獲得抗性愈傷組織和再生植株。

8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟3）共培養(yǎng)是在23-27℃的黑暗條件下進行培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)的條件為：溫度23-27℃，光照強度1000Lx，光照時間16h/d。

9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟4）報告基因的瞬時表達檢測是將共培養(yǎng)后的胚性愈傷組織漂洗干凈后置于GUS染色液中進行染色， PCR擴增檢測是以目的基因的特異性引物對抗性再生植株的基因組DNA進行擴增分析其整合與否。