[發明專利]一種楸樹遺轉化體系的構建方法

在審

• 申請號: 201710331117.1
• 申請日: 2017-05-11
• 公開（公告）號: CN107058374A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 梁宏偉;劉佳;陳發菊;張德春;沈祥陵;劉文
• 申請（專利權）人: 三峽大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所42103
• 代理人: 成鋼

技術領域

本發明屬于植物的遺傳轉化體系的構建方法領域，涉及一種楸樹遺轉化體系的構建方法。

背景技術

楸樹（Catalpa bungeiC.A.Mey）是紫葳科梓樹屬的落葉喬木，是中國珍貴的用材樹種之一，在工業用材，園林觀賞，生態防護，綠化城市方面有重要作用，被稱之為“木王”。楸樹利用歷史悠久，是珍貴用材樹種和著名園林觀賞樹種（唐玲等，2007年），其木材具有不翹裂、耐腐蝕、易加工、紋理美觀等特點，專用來加工高檔商品和特種產品。楸樹樹形優美，葉被密毛、皮糙枝密，有利于隔音、減聲、防噪、滯塵，且對環境中多種有毒氣體，諸如氯氣和二氧化硫等具有較強吸收能力，是我國具有較高環保價值的重要園林綠化和觀賞樹種。楸樹根系發達，屬深根性樹種，對于防治水土流失、阻滯風蝕、固定沙丘、保護農田起到了很好的作用。因此楸樹具有重要的開發利用價值。

目前有關楸樹育種研究、開發利用的情況如下，楸樹自然狀態下自交不親和，結實率低；楸樹的繁育多通過扦插與嫁接的方式，其技術環節多，育苗周期長，且長期的無性繁殖導致品種、類型和無性系單一化，且由于其自花不孕，常常使得楸樹存在著華而不實的現象，給楸樹優良品系的繁殖和推廣利用造成很大的障礙，加之材質優良加劇了人們的開發利用，造成楸樹資源的缺乏。此外，已經建立了楸樹的器官發生再生體系和滇楸的體細胞胚發生體系，體細胞胚胎發生具有快速、高增殖率及高再生率等優點，能使楸樹優良新品種快速繁殖。長期以來，楸樹的遺傳改良主要是通過雜交育種的方式進行，但林木所特有的許多生物學特性，如較長的生長周期和童期、高度雜合性和組培再生困難等，使得常規育種方法周期漫長，品種改良受到限制。利用現代分子生物學和基因工程技術，有望可以更加快速、高效地改變目標物種的性狀特征，從而極大地加快了育種的速度、提高了育種的效率。目前尚未見報道楸樹的遺傳轉化體系構建，限制了楸樹分子遺傳改良的發展。

發明內容

本發明利用已建立的高效穩定的楸樹體細胞胚胎發生體系，通過農桿菌介導法輔以超聲波處理對胚性愈傷組織進行遺傳轉化，確立相關的遺傳轉化參數，進而將外源基因轉入到楸樹基因組中，建立有效的楸樹遺傳轉化體系，能夠為今后楸樹性狀的分子遺傳改良奠定基礎。

為此，本發明提供的技術方案為：

一種楸樹遺傳轉化體系的構建方法，包括：以楸樹胚性愈傷組織為轉化受體，確立其潮霉素的臨界致死濃度，再依次通過工程菌液的制備、胚性愈傷組織的侵染、超聲波輔助處理、共培養和選擇培養、瞬時表達檢測和PCR檢測。

1）胚性愈傷組織的潮霉素臨界致死濃度的確定：將楸樹幼胚誘導的胚性愈傷組織接種到附加不同濃度的潮霉素的選擇培養基中培養統計存活率，得到胚性愈傷組織的潮霉素臨界致死濃度；

2）農桿菌介導輔以超聲波處理進行侵染轉化：使用含有目的基因的農桿菌工程菌液對胚性組織進行侵染轉化，侵染的同時進行超聲波輔助處理；

3）侵染處理的胚性愈傷組織的共培養和選擇培養：經過步驟2）侵染轉化后將胚性愈傷組織置于增殖培養基中進行共培養，共培養后轉置于選擇培養基中進行轉化子的選擇培養，選擇培養過程中未轉化組織將被抗生素殺死，存活下來的抗性愈傷組織和再生植株可進行下一步的轉化檢測；

4）轉化愈傷組織的報告基因瞬時表達和再生植株的PCR檢測：對經過步驟3）共培養后的胚性愈傷組織進行報告基因的瞬時表達檢測，對步驟3）選擇培養過程中獲得抗性再生植株進行PCR擴增檢測；

完成楸樹遺轉化體系的構建。

優選的是，所述楸樹遺傳轉化體系的構建方法中，在進行遺傳轉化之前，還包括受體材料的獲得和保存：

取楸樹未成熟果實的幼嫩種胚，依次經75%的酒精、2%的次氯酸鈉溶液滅菌后，剝取幼嫩種胚為外植體，經過一系列誘導獲得胚性愈傷組織材料在1/2MS培養基中繼代保存，以此作為遺傳轉化受體。

優選地，所述步驟1）選擇培養基為1/2MS固態培養基添加10-80mg/L的潮霉素，將0.3-0.4cm見方的小塊胚性愈傷組織接種在附加10-80mg/L潮霉素的1/2MS固態培養基中，篩選胚性愈傷組織的臨界致死濃度。

優選地，所述潮霉素臨界致死濃度的篩選過程中，經過3周的培養確定胚性愈傷組織的臨界致死濃度為60mg/L的潮霉素。經過3周的培養即可體現出潮霉素的篩選效果。