[發(fā)明專利]一種富含細(xì)胞因子的脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合移植材料的制備及其臨床應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710331046.5
• 申請(qǐng)日: 2017-05-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107224614A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黎洪棉;梁至潔;朱丹丹;吳芳曉;何寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黎洪棉
• 主分類(lèi)號(hào): A61L27/38
• 分類(lèi)號(hào): A61L27/38;A61L27/54;C12N5/077;C12N5/0775;C07K14/75
• 代理公司: 廣西南寧公平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司45104
• 代理人: 王素娥

1.一種富含細(xì)胞因子的脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合移植材料的制備，其特征在于，制備方法包括以下步驟：

1)脂肪顆粒團(tuán)的獲取與純化

選取大腿上段內(nèi)外側(cè)或下腹部為供區(qū)，用手持20ml針筒預(yù)留空氣法低負(fù)壓抽取，根據(jù)患者情況，選定脂肪供區(qū)位置后，局部腫脹液浸潤(rùn)麻醉，采用自行設(shè)計(jì)的多孔專用吸脂針進(jìn)行抽吸，抽吸時(shí)由深層向淺層抽吸，扇形反復(fù)抽吸；將抽吸出來(lái)的脂肪顆粒，采用生理鹽水沖洗備用；采取低速離心方法獲取并純化脂肪顆粒團(tuán)，離心轉(zhuǎn)速600rpm/min，離心時(shí)間2min，操作過(guò)程全程遵循無(wú)菌密閉操作原則，盡量減少脂肪組織與空氣的接觸時(shí)間；

2)納米脂肪基質(zhì)細(xì)胞的提取

將一部分脂肪顆粒團(tuán)經(jīng)機(jī)械搗碎乳化法制備富含脂肪干細(xì)胞的納米脂肪基質(zhì)細(xì)胞，將步驟1)初步處理后的顆粒脂肪經(jīng)孔徑0.5mm的濾網(wǎng)過(guò)濾，隨后將顆粒脂肪經(jīng)2個(gè)20mL注射針筒連接納米脂肪專用乳化器快速對(duì)打30次，機(jī)械乳化，用0.5mm孔徑的濾網(wǎng)再次過(guò)濾，最后經(jīng)轉(zhuǎn)速為8000rpm/min，離心時(shí)間為5min高速離心去除油脂后得到的脂肪乳化液即為納米脂肪，這部分乳化后的納米脂肪攜帶有較多的基質(zhì)血管成分和脂肪干細(xì)胞，有利于增加基質(zhì)血管成分與脂肪細(xì)胞的接觸面，提高脂肪移植物的成活率，將機(jī)械乳化顆粒脂肪分離培養(yǎng)并傳代后獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞稱為納米脂肪來(lái)源干細(xì)胞；

3)納米脂肪來(lái)源干細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化鑒定

經(jīng)步驟2)機(jī)械乳化后的納米脂肪基質(zhì)細(xì)胞含有較多的基質(zhì)血管成分，培養(yǎng)24h后開(kāi)始有少量成纖維細(xì)胞樣形態(tài)的細(xì)胞散在貼壁，大部分未貼壁細(xì)胞為球形或圓形的雜細(xì)胞，24-48h后首次換液去除未貼壁細(xì)胞后，大部分貼壁細(xì)胞呈寬大扁平的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這些貼壁細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)，集落大小不一；集落中細(xì)胞形態(tài)為典型的梭形細(xì)胞，約7-10d可達(dá)80％～90％致密層單層，傳代后細(xì)胞形態(tài)主要為梭形，生長(zhǎng)速度較原代細(xì)胞明顯增快，如果按1：3傳代，2-3d即可長(zhǎng)滿。連續(xù)傳代培養(yǎng)10代細(xì)胞未出現(xiàn)明顯衰老現(xiàn)象，傳代后細(xì)胞經(jīng)檢測(cè)細(xì)胞倍增時(shí)間平均約為40h，各代細(xì)胞形態(tài)與傳統(tǒng)膠原酶消化法獲取的脂肪干細(xì)胞相似，第3代細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)14d，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有透亮的脂滴形成，油紅O染色可見(jiàn)脂滴被染成鮮紅色；成骨誘導(dǎo)21d后，可見(jiàn)典型的礦化鈣結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色呈鮮紅色；成軟骨誘導(dǎo)14d后，可見(jiàn)高度聚集樣生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)，呈斑片狀或結(jié)節(jié)狀，周?chē)?xì)胞呈放射狀；結(jié)節(jié)較大，肉眼可見(jiàn)；阿利辛藍(lán)染色提示結(jié)節(jié)及周邊聚集的細(xì)胞呈藍(lán)色；第3代納米脂肪來(lái)源干細(xì)胞流式細(xì)胞分析顯示CD29、CD44、CD49d、CD54、CD90和CD105呈陽(yáng)性，而CD34、CD45和CD106呈陰性；

4)富含細(xì)胞因子纖維蛋白膠的提取

抽取同一個(gè)體的適量靜脈血，置于的無(wú)菌負(fù)壓采血管內(nèi)，采用Choukroun’s法離心轉(zhuǎn)速為2700rpm/min、離心時(shí)間為12min一次性高速離心提取富含細(xì)胞因子纖維蛋白膠；

用20ml無(wú)菌注射器采集患者靜脈血液20-40ml，并密封蓋封，將無(wú)菌的離心套管放入離心機(jī)中，然后將裝有患者靜脈血液的20ml注射器放入套管中，以轉(zhuǎn)速為2700rpm/min離心12min，靜置3～5min后棄上清，去除底層紅細(xì)胞碎片，收集中間纖維蛋白凝膠層，過(guò)濾去除血清，將富含細(xì)胞因子的纖維蛋白膠收集備用；同時(shí)對(duì)PRF在1～168h時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞因子釋放濃度的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、表皮生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-1和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的濃度呈上升趨勢(shì)，這些細(xì)胞因子對(duì)促進(jìn)組織修復(fù)和再生具有重要的作用。

2.如權(quán)利要求1所述的富含細(xì)胞因子的脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合移植材料的臨床應(yīng)用，其特征在于，將納米脂肪基質(zhì)細(xì)胞、富含細(xì)胞因子纖維蛋白膠及適量顆粒脂肪按一定的比例混合形成復(fù)合移植物，用于臨床上面部、胸部及其它體表軟組織凹陷畸形的修復(fù)與矯正。