[發明專利]一種快速馴化貼壁細胞為全懸浮細胞系的方法

在審

• 申請號: 201710330836.1
• 申請日: 2017-05-11
• 公開（公告）號: CN108865967A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 關明旭;和彥良;王宇菲;蘇瑋瑋;張樹成
• 申請（專利權）人: 華威特（江蘇）生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進

1.一種快速馴化貼壁細胞為全懸浮細胞系的方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

1）將低傳代健康貼壁細胞直接接種到無血清、無微載體培養基的轉瓶中馴化培養；

2）當細胞適應了大于6rpm轉瓶機的轉速，即細胞密度增長達到1x106細胞/mL后，將細胞轉到搖瓶中，用新鮮無血清、無微載體培養基將細胞起始密度調整至5x10⁵細胞/mL，搖瓶轉速調整為10-40rpm；

3）如果4-5天后細胞密度增長達不到1x10⁶細胞/mL，將細胞離心沉淀后用新鮮無血清、無微載體培養基將細胞密度調整在5x10⁵ 細胞/mL后繼續馴化培養，反復這一馴化步驟直到細胞密度在4-6天后≥10倍增長，即可完成馴化培養；

4）按照上述馴化培養，經過10代以上搖瓶傳代馴化培養后，即可獲得穩定的全懸浮細胞系。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的無血清、無微載體培養基為加有2mML-谷氨酰胺的MDCK-S細胞無血清培養基。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

1）將低傳代健康貼壁細胞接種到含無血清、無微載體培養基的轉瓶中，置37℃，5％CO₂的培養箱中培養，轉瓶機的速度調整為2-4rpm，細胞起始密度為5 × 10⁵細胞/mL、存活率為95%以上；

2）當培養4-5天后，或細胞密度達到1×10⁶細胞/mL，將部分貼壁細胞消化分散并與培養基中懸浮細胞混合離心沉淀后，再用等量新鮮無血清、無微載體培養基將細胞密度調整到5x10⁵ 細胞/mL后繼續轉瓶傳代培養，轉瓶機的速度調整為3-6rpm，其后每傳代一次，相應地調高轉瓶機的速度1-2 rpm ；

3）當細胞適應了大于6rpm轉瓶機的轉速后，用等量新鮮無血清、無微載體培養基再將細胞密度調整到5 x10⁵ 細胞/mL并轉到搖瓶中馴化培養，將搖瓶置37℃，5％CO₂的培養箱搖床中，搖床的速度調整為10-40rpm，如果4-5天后細胞密度增長達不到1x10⁶細胞/mL，應將細胞離心沉淀后用新鮮無血清、無微載體培養基將細胞密度調整在5x10⁵ 細胞/mL后繼續馴化培養，反復這一馴化步驟直到細胞密度在4-6天后≥10倍增長，即可完成馴化培養；

4）按照上述馴化培養，經過10-16代搖瓶傳代培養后，即可得到穩定的全懸浮細胞系。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，低傳代健康貼壁細胞直接接種到無血清、無微載體培養基的轉瓶前，先制成細胞懸液，細胞懸液的制備過程包括如下：

1）選擇低傳代，健康的貼壁細胞常規培養在玻璃方瓶中，待細胞單層生長至70-80%后，用不含鈣離子和鎂離子的磷酸鹽緩沖溶液 清洗細胞單層后，加胰蛋白酶-EDTA 消化液分散細胞，然后加胰蛋白酶抑制劑溶液終止消化反應，得到細胞懸液；

2）將細胞懸液轉移到 15mL 離心管中常規離心，棄上清，重復清洗2次后，再次用不含鈣離子和鎂離子的磷酸鹽緩沖溶液懸浮細胞，根據臺盼藍染色計得細胞數和存活率，將懸浮的細胞稀釋至5×10⁵細胞/mL。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的貼壁細胞為貼壁MDCK，CRFK，MDBK，MDOK, ST，PK-15，NBL-6，RK－13,Vero, Marc104 , Marc-145或BHK－21細胞。

6.權利要求1-5任一權利要求所述的全懸浮細胞系對多種病毒敏感，可用于流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒，腺病毒，腺相關病毒，冠狀病毒，皰疹類病毒，腸道病毒，包括：豬腺病毒，綿羊腺病毒，豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，豬流行性腹瀉病毒，豬瘟病毒，豬痘病毒，水瘡性口炎病毒，豬水泡病毒，杯狀病毒，呼腸孤病毒，牛病毒性腹瀉病毒，傳染性牛鼻氣管和羊藍舌病病毒、狗腺病毒，狗副流感病毒，狂犬病毒，偽狂犬病毒，狗瘟病毒，狗冠狀病毒或犬細小病毒疫苗的生產。