[發(fā)明專利]一種快速馴化貼壁細(xì)胞為全懸浮細(xì)胞系的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710330836.1
• 申請(qǐng)日: 2017-05-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108865967A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 關(guān)明旭;和彥良;王宇菲;蘇瑋瑋;張樹(shù)成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華威特（江蘇）生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/00
• 分類號(hào): C12N5/00
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進(jìn)

本發(fā)明公開(kāi)了一種快速馴化貼壁細(xì)胞成為全懸浮細(xì)胞系的方法，將低傳代健康貼壁細(xì)胞直接接種到無(wú)血清、無(wú)微載體培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)瓶中馴化培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞適應(yīng)了大于6rpm轉(zhuǎn)瓶機(jī)的轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)到搖瓶中，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞起始密度調(diào)整至5x10⁵細(xì)胞/mL，搖瓶轉(zhuǎn)速調(diào)整為10?40rpm；如果4?5天后細(xì)胞密度增長(zhǎng)達(dá)不到1x10⁶細(xì)胞/mL，將細(xì)胞離心沉淀后用新鮮無(wú)血清、無(wú)微載體培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整在5x10⁵細(xì)胞/mL后繼續(xù)馴化培養(yǎng)，反復(fù)這一馴化步驟直到細(xì)胞密度在4?6天后≥10倍增長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)10代以上搖瓶傳代馴化培養(yǎng)，即可獲得全懸浮細(xì)胞系，該方法簡(jiǎn)便，快速，重復(fù)性好，成功率高，全懸浮細(xì)胞系穩(wěn)定并且對(duì)病毒的感染性不變。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種快速馴化貼壁細(xì)胞為全懸浮細(xì)胞系的方法。

背景技術(shù)

將貼壁細(xì)胞馴化成為全懸浮細(xì)胞是國(guó)內(nèi)外研究和大規(guī)模生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)和疫苗發(fā)展的趨勢(shì)。大多數(shù)脊椎動(dòng)物細(xì)胞是貼壁細(xì)胞。在生產(chǎn)中常常使用這種貼壁細(xì)胞（Wurm等人，2004）。然而，使用貼壁細(xì)胞時(shí)，常會(huì)遇到一些困難，例如，（1）為了讓細(xì)胞能夠附著，必須使用如瓶和微載體等以形成細(xì)胞單層。大量生產(chǎn)時(shí)就必需選用更大的培養(yǎng)容器或反應(yīng)器。（2）在培養(yǎng)貼壁細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)基中須加入一定量的牛血清，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)因子和滿足細(xì)胞貼壁需求的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但是，牛血清存在批間差，且質(zhì)量不穩(wěn)定，同時(shí)生產(chǎn)成本也會(huì)增加，另外，為清除終產(chǎn)品中血清蛋白含量而增加了生產(chǎn)下游的工作量和污染的機(jī)會(huì)（Fortis等人，2006）。（3）為了細(xì)胞傳代常要使用胰蛋白酶消化細(xì)胞單層，這個(gè)程序也會(huì)增加產(chǎn)品的成本和污染的機(jī)會(huì)。綜上所述，目前急需一種經(jīng)濟(jì)，簡(jiǎn)便，安全和低成本的細(xì)胞生產(chǎn)工藝（Buffer 2015）。

許多細(xì)胞系容易適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基環(huán)境，而有些細(xì)胞是很難適應(yīng)這樣的培養(yǎng)條件，因此，重要的是需要有更好的方法讓細(xì)胞適應(yīng)這種無(wú)血清培養(yǎng)基和全懸浮培養(yǎng)。

國(guó)內(nèi)外也已有一些關(guān)于馴化方法方面的報(bào)道。可以查到已發(fā)表的貼壁細(xì)胞馴化方法是直接法和漸進(jìn)法，直接法是直接在無(wú)血清或不含血清培養(yǎng)中馴化某些貼壁細(xì)胞的方法，但是到目前為止，未見(jiàn)有用直接法成功馴化貼壁細(xì)胞的報(bào)導(dǎo)，因此許多人建議不使用這種方法；漸進(jìn)法是比較常用的方法，即將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)在血清濃度遞減的培養(yǎng)基里，直至過(guò)渡到無(wú)血清的懸浮培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)若干代馴化后，最終獲得全懸浮細(xì)胞系，這種漸進(jìn)馴化法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力和費(fèi)材料而且成功率低。

我們認(rèn)為除馴化方法十分重要外，對(duì)于培養(yǎng)基的選擇也很關(guān)鍵，往往決定細(xì)胞馴化的成敗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種快速馴化貼壁細(xì)胞為全懸浮細(xì)胞系的方法，該方法類似于直接法，其特點(diǎn)是簡(jiǎn)便，快速，重復(fù)性好，成功率高，全懸浮細(xì)胞系穩(wěn)定并且對(duì)病毒的感染性不變。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是這樣的，一種快速馴化貼壁細(xì)胞為全懸浮細(xì)胞系的方法，具體包括如下步驟：

1）將低傳代健康貼壁細(xì)胞直接接種到無(wú)血清、無(wú)微載體培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)瓶中馴化培養(yǎng)；

2）當(dāng)細(xì)胞適應(yīng)了大于6rpm轉(zhuǎn)瓶機(jī)的轉(zhuǎn)速，即細(xì)胞密度增長(zhǎng)達(dá)到1x106細(xì)胞/mL后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)到搖瓶中，用新鮮無(wú)血清、無(wú)微載體培養(yǎng)基將細(xì)胞起始密度調(diào)整至5x10⁵細(xì)胞/mL、搖瓶轉(zhuǎn)速調(diào)整為10-40rpm；

3）如果4-5天后細(xì)胞密度增長(zhǎng)達(dá)不到1x10⁶細(xì)胞/mL，將細(xì)胞離心沉淀后用新鮮無(wú)血清、無(wú)微載體培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整在5x10⁵ 細(xì)胞/mL后繼續(xù)馴化培養(yǎng)，反復(fù)這一馴化步驟直到細(xì)胞密度在4-6天后≥10倍增長(zhǎng)，即可完成馴化培養(yǎng)；

4）按照上述馴化培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)10代以上搖瓶傳代馴化培養(yǎng)后，即可獲得穩(wěn)定的全懸浮細(xì)胞系。