[發(fā)明專利]一種同時(shí)獲得山銀花中物質(zhì)成分和總抗氧化活性的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710330791.8
• 申請(qǐng)日: 2017-05-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107144661B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張水寒;黃建華;周融融
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南省中醫(yī)藥研究院
• 主分類號(hào): G01N30/89
• 分類號(hào): G01N30/89;G01N30/74;G01N30/14;G01N30/86
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種同時(shí)獲得山銀花中物質(zhì)成分和總抗氧化活性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括：

供試品溶液的制備：精密稱取山銀花樣品0.5g于50mL錐形瓶中，加入10mL60％乙醇，65℃下超聲30min，功率300W，取2.0mL上清液于EP管中，10000r/min離心；精密移取1.0mL上清液于25.0mL容量瓶中，定容，即得供試品溶液；

DPPH溶液的制備：精密稱取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品2.0mg，置于50mL棕色容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，避光放置，備用

配制一系列濃度梯度的VC溶液作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以DPPH為清除對(duì)象，進(jìn)行HPLC-DPPH分析，建立VC濃度與自由基清除率關(guān)系的回歸方程；

將供試品溶液注入HPLC-DPPH分析系統(tǒng)，同時(shí)得到樣品的化學(xué)成分信息和樣品的自由基總清除率，代入所述回歸方程，得到樣品總抗氧化活性；分析條件如下：

色譜柱：C₁₈反相色譜柱；

流動(dòng)相：乙腈為A相，0.1％甲酸為B相；

梯度洗脫條件：0～10min，A相11.5％→15％；10～12min，A相15％→29％；12～15min，A相29％→31％；15～20min，A相31％→45％；20～30min，A相45％→100％；

供試品溶液注入HPLC-DPPH分析系統(tǒng)后分別進(jìn)入色譜分析柱和紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器，即柱前分離；

所述HPLC-DPPH分析系統(tǒng)，包括高效液相色譜分離系統(tǒng)、自由基清除檢測(cè)系統(tǒng)和流動(dòng)相切換分流裝置，所述流動(dòng)相切換分流裝置設(shè)置在高效液相分離柱前，使得能夠同時(shí)對(duì)樣品中化學(xué)物質(zhì)和抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定；所述高效液相色譜分離系統(tǒng)包括二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、色譜分析柱及柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器；所述自由基清除檢測(cè)系統(tǒng)包括DPPH溶液泵、混合器、反應(yīng)盤管、紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器；將所述的兩部分系統(tǒng)進(jìn)行組合，系統(tǒng)依次連接為二元梯度泵、混合器、色譜柱、DAD檢測(cè)器、DPPH泵、反應(yīng)盤管、DAD檢測(cè)器；其中所述混合器與自動(dòng)進(jìn)樣器連接。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，分析條件如下：色譜柱：Agilent TC-C₁₈(2)，4.6mm×250mm,5μm；和/或，溫度：20℃；和/或，檢測(cè)波長(zhǎng)：323nm；和/或，進(jìn)樣量：10μL；和/或，流速：1.0mL/min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，VC標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制的制備方法包括：精確稱取2.5mg VC標(biāo)準(zhǔn)品，置于50mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻；精確量取2.5mL、5.0mL、7.5mL、10.0mL標(biāo)準(zhǔn)液，分別置于25mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻備用。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，制備供試品溶液時(shí)先將待測(cè)樣品山銀花干燥粉碎，過(guò)三號(hào)篩。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述獲得維生素C清除自由基濃度回歸方程的方法包括：

1)精密移取1mL不同濃度VC標(biāo)準(zhǔn)溶液與4mL DPPH溶液于試管中，搖勻，避光放置30min，于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A₁；

2)精密移取1mL不同濃度VC標(biāo)準(zhǔn)溶液與4mL無(wú)水乙醇于試管中，搖勻，避光放置30min，于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A₂；

3)精密移取1mL蒸餾水與4mL DPPH溶液于試管中，搖勻，避光放置30min，于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A₀；按下式計(jì)算清除率：

清除率＝[1-(A₁-A₂)/A₀]×100％

以清除率為縱坐標(biāo)，VC溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得維生素C清除自由基濃度回歸方程。