[發明專利]一種人血漿轉鐵蛋白分離純化的方法

在審

• 申請號: 201710330353.1
• 申請日: 2017-05-11
• 公開（公告）號: CN107216384A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 何潔;郭采平;丁玉江;譚淑嫻;王錦才;張戰;張運佳;黃偉榮
• 申請（專利權）人: 深圳市衛光生物制品股份有限公司
• 主分類號: C07K14/79
• 分類號: C07K14/79;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司44202
• 代理人: 宋靜娜,郝傳鑫

技術領域

本發明屬于蛋白質分離純化領域，尤其涉及一種人血漿轉鐵蛋白分離純化的方法。

背景技術

人血漿轉鐵蛋白是一種重要的β-球蛋白，分子量為79kDa，等電點約為5.9左右。轉鐵蛋白是一種單鏈糖基化蛋白，糖基約占10％，由C端和N端兩個具有高度同源性的結構域組成，兩個結構域都由一個短肽連接，而且，C端和N端都由兩個大小相同的小亞基構成，兩個小亞基之間的間隙則是Fe³⁺結合位點，因此，轉鐵蛋白有2個鐵離子結合位點。根據結合數目及位點的不同，轉鐵蛋白有四種形式，分別是無鐵離子結合轉鐵蛋白、只有N端結合鐵離子的轉鐵蛋白、只有C端結合鐵離子的轉鐵蛋白以及N端和C端都結合鐵離子的轉鐵蛋白。正常條件下，轉鐵蛋白的鐵離子飽和度是20％-35％。人血漿中轉鐵蛋白的濃度約為2.0～3.0g/L。轉鐵蛋白是人血漿和組織細胞外空間的主要鐵載體，其主要生理功能是把鐵離子從吸收和儲存的地方運輸到紅細胞供合成血紅蛋白用，或輸送到機體的其他需鐵部位。轉鐵蛋白結合的鐵不會催化羥基自由基形成，而且可以使鐵離子遠離細菌和真菌，因此轉鐵蛋白具有抗氧化和抗菌的作用。轉鐵蛋白可用于治療先天性無轉鐵蛋白性貧血、鐵功能缺乏、非轉鐵蛋白結合的鐵結合治療、細胞培養以及藥物載體等。

患有白血病和其他惡性腫瘤的患者通常具有轉鐵蛋白的水平較低，在高劑量的化療過程中，轉鐵蛋白的轉運鐵能力超載，導致游離的鐵離子將會富集在體內。骨髓性化療和骨髓干細胞移植的過程中，同樣會有非轉鐵蛋白結合的鐵離子富集的情況。這些非轉鐵蛋白結合的鐵離子會促進細菌和真菌生長，使病人容易發生敗血癥感染。因此，鐵結合治療對于避免非轉鐵蛋白結合鐵的毒副作用和敗血癥感染顯得尤其必要。目前，臨床上使用小分子量的鐵螯合劑，但結合能力有限，而且有劑量相關的毒性。人血漿來源的無鐵離子結合的轉鐵蛋白將會更適合于用于臨床上的鐵離子結合治療，因此研究其分離純化尤其必要。

早在上世紀中期的時候，轉鐵蛋白的分離純化主要為沉淀法，包括乙醇沉淀、利凡諾沉淀和硫酸銨沉淀。但沉淀法得到的轉鐵蛋白純度和回收率較低。隨后，層析法逐漸被廣泛應用于轉鐵蛋白的分離純化，但層析法分離純化仍存在一些問題：(1)盡管純度已達到要求，但是回收率較低，純度和回收率不能同時達到最優。(2)有些方法在層析之前需進行一步或多步沉淀，增加了操作步驟和成本，降低回收率。(3)有些方法使用了昂貴的親和層析。因此，尋求一種可以得到高純度以及高回收率轉鐵蛋白的高效分離純化方法顯得非常重要。

發明內容

為了得到高純度以及高回收率轉鐵蛋白，同時降低純化回收成本，本發明提供一種分離純化人血漿轉鐵蛋白的方法，本發明的方法經過陰離子交換層析和疏水作用層析，即可分離純化得到鐵蛋白，大大提高了血漿的綜合利用度。本發明制備出的轉鐵蛋白具有高純度、高回收率、步驟簡單以及易規模化生產的特點，解決了目前其純化方法存在的問題。

本發明采用的技術方案為：一種人血漿轉鐵蛋白分離純化方法，包括以下步驟：

1)將人血漿組分FIV-1蛋白沉淀溶解于緩沖液中，過濾，得濾液；

2)利用陰離子交換層析對步驟1)得到的濾液進行分離，收集含轉鐵蛋白的洗脫液；

3)將步驟2)得到的洗脫液進行病毒滅活，過濾、透析后，收集透析液；

4)利用疏水作用層析對步驟3)中的透析液進行二次分離，得含轉鐵蛋白的穿透液。

作為對上述技術方案的進一步改進，所述步驟4)之后還包括步驟5)：將步驟4)得到的含轉鐵蛋白的洗脫液進行超濾之后進行病毒過濾、除菌過濾，分裝凍干。

在上述技術方案中，FIV-1蛋白沉淀是采用低溫乙醇-Cohn法分離血漿蛋白工藝產生的。采用低溫乙醇-Cohn法分離血漿蛋白，可以沉淀產生組份Ι、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V五種組份，即FΙ、FⅡ、FⅢ、FⅣ、FV，而FⅣ又可分為組分IV-1和IV-2，即FIV-1和FIV-2，是低溫乙醇法不同步驟得到的產物表示。其中，FIV-1又分為FIV-1上清液和FIV-1沉淀，FIV-1上清液用來提取其他蛋白，FIV-1沉淀現在血液制品企業一般廢棄，為了提高人血漿的綜合利用度，本發明將FIV-1沉淀再用緩沖液溶解，用于轉鐵蛋白的純化。

作為對上述技術方案的進一步改進，所述步驟1)中溶解FIV-1沉淀的緩沖液的pH為7.0～9.0；

優選地，所述的緩沖液為pH 7.0-9.0，10～100mM的磷酸鹽緩沖液或pH7.0～9.0，10～100mM的Tris-HCl緩沖液。