[發明專利]小麥矮腥黑粉菌原生質體的制備方法

在審

• 申請號: 201710328722.3
• 申請日: 2017-05-11
• 公開（公告）號: CN107058132A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 高利;沈慧敏;陳萬權;劉太國;劉博
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司11129
• 代理人: 高芬芳

技術領域

本發明涉及細胞工程中真菌原生質體制備與再生技術領域，具體涉及一種小麥矮腥黑粉菌原生質體的制備方法。

背景技術

小麥矮腥黑穗病(wheat dwarf bunt disease，DB)是一種由小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)引起的檢疫性病害，具有危害嚴重、防治困難等特點，對小麥的生產具有毀滅性破壞。感病植株通常具有矮化多分蘗的癥狀，穗上的籽粒變成黑粉，是病原菌的冬孢子，冬孢子有魚腥味，引起小麥產量和品質降低。國內外對于小麥矮腥黑穗病的研究主要集中在病原菌的鑒定、生物學特性以及分子檢測技術等，對該病原菌的致病機制研究較少。遺傳轉化技術是實現大規模定點突變的重要方法，利用該技術能夠改變真菌的遺傳物質，研究植物病原菌的的致病機理。目前，真菌遺傳轉化的方法有很多，常見的有聚乙二醇介導的原生質體轉化、限制性內切酶介導的整合以及農桿菌轉化等。

當前，利用原生質體進行分子轉化技術已成為絲狀真菌轉化、相關分子克隆技術和致病機制研究的重要組成部分，原生質體分子轉化技術依賴于制備高效可再生的原生質體，但由于不同種類絲狀真菌細胞結構，尤其是細胞壁的結構和組成存在著明顯差異，因此制備原生質體的最佳條件和體系也存在著很大差異。國內外尚未見小麥矮腥黑粉菌的原生質體制備體系相關報道，這不利于對該病原菌進行深入的致病分子機制研究。原生質體的高效再生是后期深入研究其致病分子機制的必需條件，不同的酶解時間及穩滲劑對原生質體再生具有重要影響。為了篩選小麥矮腥黑粉菌致病力變異菌株，加強對其致病機制的了解，更好地為農業生產上開展抗病分子育種提供基礎，需要對其原生質體制備及再生的方法進行研究。

發明內容

針對上述領域存在的不足和需求，本發明的目的在于提供一種小麥矮腥黑粉菌原生質體的制備方法。

本發明通過如下技術方案實現：

小麥矮腥黑粉菌原生質體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)菌絲培養：在土壤浸提液培養基上培養小麥矮腥黑粉菌冬孢子，待冬孢子萌發后轉接到T19液體培養基中振蕩培養，在土壤浸提液培養基上培養的天數與在T19液體培養基中振蕩培養的天數總共為40～50天，收集菌絲體；

(2)細胞壁裂解：以KCl溶液作為滲透壓穩定劑，配制混合酶液，加入到菌絲體中，28℃振蕩酶解2～3小時，即得到小麥矮腥黑粉菌原生質體；

所述混合酶液包括質量百分比濃度為1.5％的崩潰酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蝸牛酶。

優選地，所述在土壤浸提液培養基上培養的天數與在T19液體培養基中振蕩培養的天數總共為45天。

優選地，所述在土壤浸提液培養基上培養小麥矮腥黑粉菌冬孢子的天數為30～35天，所述轉接到T19液體培養基中振蕩培養的天數為10～15天。

優選地，所述28℃振蕩酶解的時間為2.5小時。

優選地，所述在土壤浸提液培養基上培養小麥矮腥黑粉菌冬孢子的培養條件為溫度為5℃和相對濕度為50％；所述轉接到T19液體培養基中振蕩培養的培養條件為溫度為5℃和轉速為150rpm。

優選地，所述KCl溶液的濃度為1.2mol/L。

優選地，所述混合酶液與所述菌絲體的配比為20ml：1g。

優選地，所述振蕩酶解在180r/min的轉速下進行。

優選地，所述土壤浸提液培養基的制備方法為：稱取75g滅菌土壤，溶于500ml沸水后，過濾，取濾液，加入20g瓊脂粉，然后加水定容至1L，121℃高壓蒸汽滅菌。

優選地，所述T19液體培養基的配方為：KH₂PO₄ 613mg/L，MgSO₄·7H₂O 246mg/L，K₂HPO₄·3H₂O 114mg/L，CaCl₂ 55.5mg/L，螯合Fe 20mg/L，ZnSO₄·7H₂O 3.52mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.38mg/L，MnSO₄·H₂O 0.31mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.025mg/L，氯化硫胺素5mg/L，L-天冬酰胺3mg/L，蔗糖20mg/L。