[發明專利]一種沙門氏菌抗體乳膠凝集檢測方法

在審

• 申請號: 201710326771.3
• 申請日: 2017-05-10
• 公開（公告）號: CN107085103A
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發明（設計）人: 何偉勇;尹曉敏;陳曉鳳
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司11246
• 代理人: 陳波

技術領域

本發明屬于免疫學技術領域，具體涉及一種沙門氏菌抗體乳膠凝集檢測方法。

背景技術

沙門氏菌(Salmonella spp)是一種條件致病菌。也是一種人畜共患病病原菌，對人和動物均有致病性，也是全世界引起人類食物中毒的最主要病原菌之一，主要侵染人的腸道上皮細胞，可以造成各種病癥，輕者引起輕度腹瀉，重者出現傷寒發熱。沙門氏菌的傳播主要是通過污染的環境、食物以及飲用水，而且能夠長時間存在于環境中，長期保持感染能力，導致其難以徹底凈化。準確檢測沙門氏菌無論是在動物臨床實踐還是人類自我保護方面，都具有重要意義。

目前多種沙門氏菌檢測技術種類很多，主要包括：傳統的分離培養等檢測方法、分子生物學檢測方法和免疫學檢測方法。

傳統檢測方法主要包括：沙門氏菌分離純化、生化鑒定和血清型鑒定。傳統檢測方法中分離純化和生化鑒定操作雖然簡單，但細菌生長較慢，耗時較長；血清型鑒定雖然簡便快捷，但是特異性不高，可能會出現交叉反應。分子生物學檢測方法包括：PCR檢測技術、基因芯片技術、下一代基因測序技術 (Next generation sequencing，又稱第二代基因測序)。分子生物學檢測法快速、靈敏、特異性強，但成本較高，且要求較高技術水平，大范圍應用尚有一定難度。

免疫學檢測方法包括：酶聯免疫吸附(ELISA)、乳膠凝集試驗(Latex Agglutination Test,LAT)等。其中酶聯免疫吸附較傳統檢測方法耗時短可以實現自動化處理大量樣品，比培養方法特異性高。但使用多抗血清檢測，則特異性不強，如果使用單抗提高靈敏度和特異性，相應抗體的制備要求較高。

乳膠凝集試驗是一種間接凝集反應，首先需要將可溶性抗原(或抗體)吸附到乳膠微球表面，該乳膠微球需要具備不溶性和不發生免疫反應等條件，制成致敏乳膠后，在電解質的條件下，與特異性抗體(或抗原)反應會出現肉眼可見的凝集現象。乳膠凝集試驗具有高特異性和敏感性，而且操作簡單，試驗耗時短，適用于臨床樣本的大量檢測。但是乳膠凝集試驗存在的缺點為不易找到吸附到乳膠微的特異性和免疫反應性較好的抗原或抗體。

實驗室常用的鑒定沙門氏菌的方法為PCR和ELISA。雖然準確率高，但實驗條件要求高，且耗費大量時間。因此，迫切需要開發一種快速準確、簡便易行的檢測方法。

SEN4030是沙門氏菌表達的一段多拷貝蛋白，有5559個氨基酸，在沙門氏菌中具有高度保守性。通過生物信息學分析氨基酸序列發現，SEN4030蛋白跟鼠傷寒沙門氏菌的粘附素蛋白SiiE高度相似，只有76個氨基酸不同，由此推斷SEN4030蛋白也應該是一種粘附素類蛋白，在沙門氏菌入侵宿主細胞過程中起作用，可以影響沙門氏菌的致病性。

發明內容

本發明為了克服目前沙門氏菌檢測方法難以實現快速準確、簡便易行的問題，提出一種沙門氏菌抗體乳膠凝集檢測方法。

SEN4030a蛋白為SEN4030的一部分，其編碼基因為SEN4030編碼基因中截取的第6600-8100bps序列，約1500bps。通過前期研究，SEN4030a蛋白包含免疫球蛋白樣的結構域，可以影響沙門氏菌的致病性，ELISA等相關試驗證明有較強的特異性和免疫反應性，可以應用于沙門氏菌特異性診斷。

為此，本發明的具體技術方案如下：

一種沙門氏菌抗體乳膠凝集檢測方法，包括以下步驟：

將SEN4030a蛋白，連接到空白乳膠微球上，制備致敏乳膠微球；

將致敏乳膠微球與待測樣品混勻反應，觀察凝集結果。

上述檢測方法中，所述SEN4030a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述檢測方法中，所述致敏乳膠微球的制備方法為：

將預處理后的空白乳膠微球溶液與SEN4030a蛋白溶液混合，在4-60℃下偶聯1-10小時。

上述檢測方法中，所述空白乳膠微球溶液的濃度為0.1-10wt％，所述 SEN4030a蛋白溶液的濃度為0.1-5mg/ml。

上述檢測方法中，優選的，在10-40℃下偶聯3-7小時，所述空白乳膠微球溶液的濃度為0.1-3wt％，所述SEN4030a蛋白溶液的濃度為0.1-3mg/ml。

上述檢測方法中，最優選的，在37℃下偶聯5小時，所述空白乳膠微球溶液的濃度為1wt％，所述SEN4030a蛋白溶液的濃度為0.6-0.7mg/ml。

上述檢測方法中，所述預處理的方法為：將空白乳膠微球加入去離子水，離心，再加入緩沖液稀釋，然后加入Triton X-100。