[發明專利]一種富集BRCA1和BRCA2基因目標區域的引物、方法、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201710326504.6
• 申請日: 2017-05-10
• 公開（公告）號: CN107267600B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 劉建云;汪彪
• 申請（專利權）人: 北京明諦生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所(普通合伙) 11308
• 代理人: 秦力軍

本發明公開了一種富集BRCA基因目標區域的引物、方法、試劑盒及其應用，涉及生物技術領域。所述引物具有如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.52所示的序列，是將擴增區段包含BRCA1和BRCA2基因所有外顯子和外顯子側翼的內含子區域的一套26對引物優化組合得到的5組引物對；本發明通過這5個引物組將PCR反應數降低到了5個；在對待測樣品進行擴增時，利用5組引物對中的每組引物對進行多重PCR擴增所得到的5組的擴增產物中，每組擴增產物的擴增片段之間長度有明顯區別，不但使得擴增產物質量易于監控，而且還實現待測樣品中的BRCA1和BRCA2基因目標區域的100％富集；將其用于基因序列突變的檢測，效率高、準確性好、成本低廉、方法簡單。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地涉及一種利用多重PCR富集BRCA1和BRCA2基因區域的引物、方法、試劑盒及其應用。

背景技術

BRCA1和BRCA2是重要的抑癌基因，參與染色體損傷修復過程。BRCA1和BRCA2的突變可能造成基因功能的降低或缺失，進而增加細胞癌變的風險?，F有的數據顯示，這兩個基因的胚系突變是造成遺傳性乳腺及卵巢癌的最重要因素，突變攜帶者一生中罹患乳腺癌的幾率可高達87％，卵巢癌的幾率可高達44％。因此，對高危人群進行BRCA1/2基因突變檢測，對于癌癥的預防，發現和治療有著重要的指導意義。

BRCA1和BRCA2已發現的突變大部分是單個堿基的突變或少量堿基的缺失和插入。這些突變可以造成基因產物氨基酸序列的改變、翻譯的提前終止、或信使RNA加工的異常，進而影響蛋白的功能。為了檢測這些突變，常規方法是PCR擴增得到感興趣的基因片段后，以Sanger法進行序列測定。全面掃描兩個基因所有編碼外顯子通常需要進行80個以上的PCR反應，擴增片段通常采用正反雙向測序以保證準確性，工作量較大，成本較高。

越來越多的實驗室開始采用二代測序技術來檢測BRCA1和BRCA2的突變。二代測序技術由于其高通量的特性，可以覆蓋更大的基因組區域，并且在一次測序中可以完成多個樣本的突變檢測。基因組目的區域的富集是這一技術的關鍵。大型實驗室多采用雜交捕獲技術或微滴PCR、微流體PCR等技術。這些技術各有其優點，但在成本和儀器要求上均有較高要求。

例如，申請號201610334650.9公開的用于擴增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2編碼序列的PCR引物，其主要利用引物進行兩輪PCR獲得，雖然可以得到BRCA1和BRCA2基因突變的檢測結果，但是由于其擴增出的基因片段不能完全覆蓋到目的基因的全部，即其覆蓋率不能達到100％，因此可能存在不能準確檢測出每個突變位點的技術問題。

長片段擴增(Long-range PCR)技術操作簡單，成本低廉，適應性強，同樣也是目前使用較廣的目的區域富集技術。現有的應用方式，是使用PrimeStar等適用于長片段擴增的DNA聚合酶，以10kb左右的擴增子大小覆蓋BRCA1和BRCA2整個基因組區域，共需要15-20對引物。這種方法每對引物單獨擴增，每個樣品所需的PCR反應管數較多，不利于大批量操作，由于擴增子存在重合，且擴增長度的設置決定了多重擴增產物中的各個片段無法用簡單的方式，如瓊脂糖凝膠電泳，進行分析，所以也不適于以多重PCR的方式縮減反應管數。

發明內容

本發明針對現有技術存在的問題，舍棄了部分大跨度內含子的中間區域，設計了一套共26對擴增范圍涵蓋BRCA1和BRCA2所有外顯子，和部分內含子區域，互不重疊長度在2kb至8kb之間，分組同時進行多重PCR，每個片段均能通過普通的瓊脂糖凝膠電泳進行區分。

為實現本發明的目的，本發明第一方面提供一種富集BRCA1和BRCA2基因目標區域的引物，包括：

從其擴增區段包含BRCA1和BRCA2基因所有外顯子和外顯子側翼的內含子區域的多對引物中得到的五組引物對；