[發明專利]一種基于依賴解旋酶DNA恒溫擴增技術檢測microRNA的方法

有效

• 申請號: 201710325050.0
• 申請日: 2017-05-10
• 公開（公告）號: CN107130024B
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 張春陽;馬飛;劉萌
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 薛鵬喜

本發明公開了一種基于依賴解旋酶DNA恒溫擴增技術檢測microRNA的方法，步驟如下：(1)提取樣品中的總RNA；(2)向提取的總RNA中加入單鏈DNA探針和過量的核酸外切酶I，在反應緩沖液中進行孵育，實現目標microRNA與單鏈DNA探針的特異性結合，利用過量的核酸外切酶I將多余的單鏈DNA探針消除；(3)向步驟(2)的反應體系中加入上游引物、下游引物、單鏈結合蛋白和解旋酶，對目標microRNA進行擴增反應，通過熒光信號檢測目標microRNA的表達。本發明借助核酸外切酶I的消化以降低背景、利用解旋酶輔助的恒溫擴增(HDA)反應以放大信號，實現了對microRNA的快速和高靈敏檢測。

技術領域

本發明涉及生物分析技術領域，特別是涉及一種基于依賴解旋酶DNA恒溫擴增技術檢測microRNA的方法。

背景技術

microRNA是近年來在多種真核細胞及病毒中發現的一類內源性非編碼單鏈RNA，長度為21～25nt的短序列，在進化上具有高度的保守性，能夠通過與靶mRNA特異性的堿基互補配對，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而對基因進行轉錄后的表達調控。由于microRNA序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍認為microRNA的功能是參與生命的一些基本過程，如發育過程中的細胞增殖、細胞死亡、應激反應和脂肪代謝等。

因此，microRNA被認為是一種潛在的生物標志物，實現microRNA的選擇性靈敏定量檢測對于理解其生物功能和臨床應用都具有很重要的價值。

由于microRNA分子只有21～25nt左右大小，檢測較為困難。現有的檢測方法中，核酸印跡分析作為microRNA分析的標準方法，但該方法存在著靈敏度較低(高于1納摩爾每升)、操作耗時以及樣品消耗量大等缺點，因此該方法并不適于低豐度microRNA的分析測定。

為了提高檢測靈敏度，基于聚合酶鏈式反應(PCR)和恒溫核酸擴增技術的microRNA檢測方法逐漸發展起來。基于聚合酶鏈式反應(PCR)的方法實現了檢出限的大幅降低(達到100飛摩爾每升左右)，但該方法所必需的反轉錄環節增加了探針設計的難度；此外，為了實現聚合酶鏈式反應(PCR)所需的精確溫度循環過程，需要使用價格昂貴而操作復雜的熱循環儀，這也限制了該方法的廣泛應用。

滾環擴增(RCA)、環介導恒溫擴增(LAMP)以及指數擴增反應(EXPAR)等恒溫擴增技術的發展使得microRNA的檢測可以在某一特定溫度下進行，達到了較高的靈敏度，但大多數恒溫擴增技術反應時間較長，反應機理較為復雜，難以滿足臨床檢測的需求。例如，為了達到10飛摩爾每升的檢出限，分支滾環擴增(RCA)需要長達8個小時的反應時間，而恒溫指數擴增(EXPAR)需要設計帶有限制性核酸內切酶特異性識別位點的核酸模板。

依賴解旋酶輔助的恒溫擴增(HDA)技術是核酸等溫擴增技術中的一種，該技術模擬自然界生物體內DNA復制的自然過程，在恒溫條件下利用解旋酶解開DNA雙鏈，同時DNA單鏈結合蛋白(SSB)穩定解開的單鏈為引物提供結合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互補鏈。新合成的雙鏈在解旋酶作用下又解成單鏈，并作為下一輪合成的模板進入上述循環擴增反應，最終實現靶序列的指數式增長。目前有關HDA檢測方法的報道較少，相關研究主要是利用HDA技術對一些病原菌進行檢測，但尚未見采用HDA方法檢測microRNA的報道。

發明內容

針對上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種基于依賴解旋酶DNA恒溫擴增技術檢測microRNA的方法。本發明將HDA技術引入到microRNA檢測中，實現了對microRNA的超高靈敏檢測。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種基于依賴解旋酶DNA恒溫擴增技術檢測microRNA的方法，步驟如下：

(1)提取樣品中的總RNA；