[發明專利]一種基于依賴解旋酶DNA恒溫擴增技術檢測microRNA的方法有效
| 申請號： | 201710325050.0 | 申請日： | 2017-05-10 |
| 公開（公告）號： | CN107130024B | 公開（公告）日： | 2020-03-27 |
| 發明（設計）人： | 張春陽;馬飛;劉萌 | 申請（專利權）人： | 山東師范大學 |
| 主分類號： | C12Q1/6844 | 分類號： | C12Q1/6844 |
| 代理公司： | 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221 | 代理人： | 薛鵬喜 |
| 地址： | 250014 *** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 基于 依賴 解旋酶 dna 恒溫 擴增 技術 檢測 microrna 方法 | ||
1.一種基于依賴解旋酶DNA恒溫擴增技術檢測microRNA的方法，其特征在于，步驟如下：
(1)提取樣品中的總RNA；
(2)向提取的總RNA中加入單鏈DNA探針和過量的核酸外切酶I，在反應緩沖液中進行孵育，實現目標microRNA與單鏈DNA探針的特異性結合，利用過量的核酸外切酶I將多余的單鏈DNA探針消除；
(3)向步驟(2)的反應體系中加入上游引物、下游引物、單鏈結合蛋白和解旋酶，對目標microRNA進行擴增反應，通過熒光信號檢測目標microRNA的表達；
所述單鏈DNA探針中包含HDA擴增的模板序列，并且所述單鏈DNA探針的3’末端與待檢測的目標microRNA完全互補；所述上游引物與單鏈DNA探針的3’端互補；所述下游引物與單鏈DNA探針的5’端一致，可保證HDA擴增反應的進行。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，提取樣品中的總RNA采用的方法為：利用總RNA提取試劑盒對樣品中的RNA進行抽提與純化。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述反應緩沖液中含有：1毫摩爾每升的二硫蘇糖醇、1×核酸外切酶I反應緩沖液、20個單位的RNA酶抑制劑、10毫摩爾每升的氯化鈉以及10毫摩爾每升的pH 8.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，孵育的溫度為95℃，孵育的時間為5min。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，擴增反應的溫度為60-70℃，擴增反應的時間為30min。
6.一種檢測microRNA的試劑盒，其特征在于，包括：單鏈DNA探針、上游引物和下游引物、核酸外切酶I、單鏈結合蛋白和解旋酶；
所述單鏈DNA探針中包含HDA擴增的模板序列，并且所述單鏈DNA探針的3’末端與待檢測的目標microRNA完全互補；
所述上游引物與單鏈DNA探針的3’端互補；所述下游引物與單鏈DNA探針的5’端一致。
7.一種檢測miR-21的試劑盒，包括：單鏈DNA探針、上游引物、下游引物、核酸外切酶I、單鏈結合蛋白和解旋酶；
所述單鏈DNA探針的序列如SEQ ID NO.1所示；所述上游引物和下游引物的序列分別如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
8.權利要求6所述的試劑盒在非疾病的診斷目的的檢測microRNA中的用途。
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